卤醇脱卤酶的基因挖掘、催化性能及其分子改造研究

发布时间：2020-12-18 15:56

　　卤醇脱卤酶能够在温和条件下催化邻卤醇脱卤和环氧化物的开环,在手性环氧化物和β-取代醇的合成方面具有极大的应用潜力。但是到目前为止立体选择性优异的卤醇脱卤酶仅有HheC,为了满足应用的需求,开发新型高效、选择性好、活性高的生物催化剂,已经成为卤醇脱卤酶工业应用基础研究的重点研究方向。本文首先以HheC和HheB为基因探针,通过基因挖掘法获得了10种潜在的卤醇脱卤酶基因,其中9种在大肠杆菌中成功表达。以苯基缩水甘油醚（（R,S）-PGE）为模式底物,通过显色反应和高效液相色谱检测比较,筛选获得3种高活性且具有不同选择性的卤醇脱卤酶;经引入组氨酸标签后,确定了一种来源于菌株Pseudomonas pohangensis的HHDH_His10作为后续研究对象,其与HheB的同源性为44%,与HheC的同源性为31%,并对（R,S）-PGE表现出R选择性。通过Ni-NTA柱纯化目标蛋白,并对其酶学性质进行研究。其最适脱卤反应温度为40℃,最适脱卤反应pH为10.0,最适开环反应pH为7.5,该酶在pH6.0-7.5范围内和温度低于50℃时具有较好的稳定性。HHDH_H... 

【文章来源】：江苏科技大学江苏省

【文章页数】：95 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 卤醇脱卤酶
    1.2 卤醇脱卤酶的催化机理
    1.3 卤醇脱卤酶的基因挖掘
    1.4 卤醇脱卤酶的应用
        1.4.1 卤醇脱卤酶在卤代醇脱卤反应中的应用
        1.4.2 卤醇脱卤酶在环氧化物拆分中的应用
        1.4.3 卤醇脱卤酶在单酶串联反应中的应用
        1.4.4 卤醇脱卤酶在与其他酶的偶联反应中的应用
    1.5 卤醇脱卤酶的分子改造研究
        1.5.1 卤醇脱卤酶的定向进化
        1.5.2 卤醇脱卤酶的理性或半理性设计
    1.6 本论文的研究目的及意义
    1.7 本论文的主要研究内容
第2章 卤醇脱卤酶的基因挖掘
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 主要设备与仪器
        2.2.2 菌株及质粒
        2.2.3 酶与试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 培养基及常用试剂的配制
        2.3.2 卤醇脱卤酶的基因挖掘
        2.3.3 卤醇脱卤酶表达载体的构建
        2.3.4 卤醇脱卤酶的诱导表达
        2.3.5 卤醇脱卤酶的序列分析
        2.3.6 卤醇脱卤酶的高通量筛选
        2.3.7 卤醇脱卤酶酶活测定
        2.3.8 分析方法
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 卤醇脱卤酶的基因挖掘
        2.4.2 卤醇脱卤酶的诱导表达
        2.4.3 重组卤醇脱卤酶的功能筛选
    2.5 本章小结
第3章 卤醇脱卤酶的酶学性质研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 实验仪器
        3.2.2 主要实验试剂
        3.2.3 菌株与质粒
        3.2.4 相关溶液的配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 卤醇脱卤酶的纯化
        3.3.2 卤醇脱卤酶最适温度及温度稳定性
        3.3.3 卤醇脱卤酶最适pH及 pH稳定性
        3.3.4 卤醇脱卤酶底物特异性
        3.3.5 卤醇脱卤酶动力学参数
        3.3.6 卤醇脱卤酶酶活测定
        3.3.7 分析方法
        3.3.8 卤醇脱卤酶催化拆分Rac-PGE合成手性纯的PGE
        3.3.9 卤醇脱卤酶单酶串联催化合成手性纯的1-氯-3-苯氧基-2-丙醇
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 卤醇脱卤酶的分离纯化
        3.4.2 温度对卤醇脱卤酶HHDHHis10 的酶活及稳定性的影响
        3.4.3 pH对卤醇脱卤酶的酶活及稳定性的影响
        3.4.4 卤醇脱卤酶的底物特异性
        3.4.5 卤醇脱卤酶动力学参数的测定
        3.4.6 卤醇脱卤酶催化Rac-PGE合成手性纯的PGE
        3.4.7 卤醇脱卤酶催化合成对映体纯的1-氯-3-苯氧基-2-丙醇
    3.5 本章小结
第4章 卤醇脱卤酶分子改造的初步探索
    4.1 引言
    4.2 材料
        4.2.1 菌株与质粒
        4.2.2 酶与试剂
        4.2.3 主要仪器
        4.2.4 引物
    4.3 实验方法
        4.3.1 同源建模
        4.3.2 分子对接
        4.3.3 感受态细胞的制备
        4.3.4 饱和突变文库的构建
        4.3.5 高通量筛选模型的建立与突变文库的筛选
        4.3.6 卤醇脱卤酶HHDHHis10 及其突变体的表达与分离纯化
        4.3.7 卤醇脱卤酶酶活测定
        4.3.8 卤醇脱卤酶及其突变体动力学参数的测定
        4.3.9 分析方法
        4.3.10 突变体催化拆分Rac-PGE合成手性纯的PGE
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 卤醇脱卤酶同源建模
        4.4.2 分子对接与突变位点的选择
        4.4.3 突变文库的构建及筛选
        4.4.4 卤醇脱卤酶及其突变体的分离纯化
        4.4.5 卤醇脱卤酶及其突变体的底物特异性
        4.4.6 动力学常数的测定
        4.4.7 机理分析
        4.4.8 突变体N160L催化拆分（R,S）-PGE
    4.5 本章小结
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
附录
攻读硕士学位期间所发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]迭代饱和突变提高卤醇脱卤酶HheAAM催化制备6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的酶活[J]. 王露,徐刚,杨立荣,吴坚平.  高校化学工程学报. 2018(05)
[2]甘油原料转化生产手性环氧氯丙烷关键酶的开发[J]. 张晓健,郑裕国.  生物产业技术. 2017(06)
[3]多酶偶联催化制备手性化合物（S）-环氧苯乙烷[J]. 朱利娟,胡蝶,储亚琴,臧嘉,余涛,邬敏辰.  食品与生物技术学报. 2017(05)
[4]固定化卤醇脱卤酶的制备及催化合成ATS-5的稳定性考察[J]. 梁国斌,翟良创,汪斌,姚佳,周全法.  轻工学报. 2017(02)
[5]新型卤代醇脱卤酶基因的克隆、序列分析及表达[J]. 冯峰,胡蝶,余涛,曾妍,邬敏辰.  食品与生物技术学报. 2015(05)
[6]后基因组时代工业酶资源的挖掘和应用[J]. 李春秀,许建和.  生物产业技术. 2011(01)
[7]一种新型微生物卤醇脱卤酶的研究进展[J]. 郑楷,汤丽霞.  生物技术通讯. 2010(01)
[8]多功能生物催化剂——卤醇脱卤酶的研究进展[J]. 郑楷,汤丽霞.  化工学报. 2008(12)

博士论文
[1]甘油化学酶法合成光学纯环氧氯丙烷关键酶的挖掘与改造[D]. 薛锋.浙江工业大学 2015

硕士论文
[1]定向进化提高卤代醇脱卤酶HHDH的催化活性[D]. 王金玉.浙江大学 2016
[2]基于定向进化方法改进卤醇脱卤酶HheC的热稳定性[D]. 武志赟.电子科技大学 2015
[3]卤醇脱卤酶C（HheC）的分子定向进化研究[D]. 刘羽.电子科技大学 2013
[4]卤醇脱卤酶HheA的改造和生物催化特性的研究[D]. 朱学琛.电子科技大学 2012
[5]环氧水解酶的克隆表达和催化性能研究[D]. 赵晶.华东理工大学 2011
[6]卤醇脱卤酶HheC的改造及其在手性药物合成中的应用[D]. 郑楷.电子科技大学 2011



本文编号：2924265