代谢工程大肠杆菌利用乙酸合成丙酮与异丙醇的途径优化

发布时间：2020-12-18 22:45

　　丙酮和异丙醇作为重要的有机化合物,广泛应用于医药、农药、化工等行业。丙酮（异丙醇）发酵法是生产丙酮（异丙醇）的传统生物方法。但目前微生物发酵法因其产物特异性差、粮食基底物消耗大而受到了限制。利用成本低、效益高的非粮食基底物进行特异性合成丙酮和异丙醇成为研究热点。乙酸是一种可以通过生物法和化学合成法制备的廉价一元酸。与此同时,它也大量存在于许多制造业的废水中。大肠杆菌可以好氧代谢乙酸进行生长,但以乙酸为唯一碳源来生产丙酮及异丙醇则没有被报道。对大肠杆菌进行基因改造修饰具有相当的潜力来解决这些问题。本课题通过在大肠杆菌MG1655中组合表达Clostridium acetobutylicum来源的基因（硫解酶thl、乙酰乙酸脱羧酶adc、辅酶A转移酶ctfAB）和大肠杆菌来源的基因（辅酶A乙酰转移酶atoB、辅酶A转移酶atoDA）合成丙酮。在乙酸为唯一碳源下,以thl、attoDA、adc为最优的丙酮合成途径。并通过背景菌株改造,过表达基因ack-pta以提高乙酸摄取、敲除基因pckA、maeBB来削弱糖异生途径、敲除基因icdA来阻断TCA循环途径提高了丙酮得率。结合静息细胞转化与气提... 

【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１．１丙酮代谢途径简图??Ｆｉｇ．?１．１?Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ?ｍｅｔａｂｏｌｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?ａｃｅｔｏｎｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ??

利用ＥＣＯＣＹＣ及ＮＣＢＩ网站，查找并下载ｐＴｒｃ９９ａ质粒图谱与相关基因（从／，Ｃ抑（７／ＯＺＸ４）序列。梭菌丙酮合成途径的反应顺序为，抑５。考虑到大杆菌中除了不含有乙酰乙酸脱羧酶，存在两种酶的同工酶。对这两种不同来源的基因行组合，可以得到?４?种质粒组合。即：（（７／〇５，说／ｃ，?Ｃ／／４５），（ａ／減“成?（／／？／，?ａｄｃ，?Ｃ／／４和（／／７／，Ｗｃ，加ＺＸ４）；用Ｖｅｃｔｏｒ软件，设计基因连接顺序并进行电子克隆。??

ｐｌａｓｍｉｄ?ｃａｒｒｉｎｇ?＂７／?（Ｃ．?ａｃｅ／ｏｉｗ／ｙ／ｚ’ｃｗｗ）?ｇｅｎｅ?ｏｆ?ｔｈｉｏｌａｓｅ、ａｄｃ?（Ｃ．?ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）?ｇｅｎｅ?ｏｆ?ａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ??ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、７＞ｃ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ａｔｏＤＡ?（Ｅ．?ｃｏｌｉ）?ｇｅｎｅ?ｏｆ?ＣｏＡ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．??电子克隆结果如图３．１：按照天然丙酮合成天然途径的反应顺序，在ｐＴｒｃ９９ａ质粒??／／ｒ启动子后插入也ｏＳ／从／基因，并设计相应的ＲＢＳ序列以连接基因。为有效表达??三个基因，再引入一个带有终止子元件的／ｒｃ启动子元件，在该元件后连接如??基因。以此得到质粒大小分别为?ｐＴｒｃＢＡＣ?（７７４８?ｂｐ）、ｐＴｒｃＢＡＤ?（７７３７?ｂｐ）、ｐＴｒｃＴＡＣ??（７７３０ｂｐ）、ｐＴｒｃＴＡＤ?（７７１９ｂｐ）。质粒的详细描述见第二章２．１．２。后续的克隆实验设计将??以电子克隆为参考进行。??３．２．１．１目的基因的获取??分别以丙丁梭菌Ｃ．?菌体、大肠杆菌ＭＧ１６５５菌体为扩增模版，ＰＣＲ??扩增／／？／、ｃ抑Ｂ、偷５、基因序列，其中／／？／与?ａｔ／ｃ?之间的??ＲＢＳ?序列以及?与?ｃ／ｔ／ｃ？之间的?ＲＢＳ?序列由（ｈＵｉ，ｓ：／／ｓａ丨ｉｓ?１?ａｂ．ｌｉｅｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｆｏｒｗａｒｄ）网页??软件计算得出。获得各基因片段后，再通过ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲ获得／Ｗ－ＲＢＳ－ａ也与ａ／ｏＳ－ＲＢＳ－??〇办片段。由于需要在ｐＴｒｃ９９ａ表达载体上表达３个基因，仅载体上的一个Ｔｒｃ启动子，??表达强度不够。因此

【参考文献】：
期刊论文
[1]异丙醇的应用及国内外市场[J]. 胡红嫣.  当代石油石化. 2003(05)
[2]丙酮的生产与发展[J]. 韩大维,薛丽梅,王焕民,王镜石.  化学与粘合. 1996(04)
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本文编号：2924732