多倍体酵母合成型V号染色体的重排

发布时间：2020-12-23 01:45

　　酵母的多倍体化和非整倍体化都属于大范围的基因组结构变异,都是工业用酵母菌株的重要的遗传变异形式,其中酵母交配型转换是非常关键的一步。本研究开发了基于CRISPR/Cas9的酵母交配型转换方法,通过一次酵母转化,即可完成单倍体和二倍体酵母细胞的交配型转换,且交配型转换的效率均可达到80%以上。应用CRISPR/Cas9介导的交配型转换方法,本研究构建了含有两条合成型染色体（synV和synX）的单倍体酵母,并且实现了同源野生型三倍体、四倍体、五倍体酵母菌株的构建。为了验证多倍体基因组重排的效果,我们将玉米黄质生物合成模块整合在野生型V号染色体上,构建得到了产玉米黄质的野生型二倍体、三倍体和四倍体酵母菌株,以及含有合成型染色体的杂合二倍体、三倍体和四倍体酵母菌株。本研究利用玉米黄质的产量作为筛选酵母有益结构变异的指标,在合成型多倍体酵母中诱导synV染色体的重排。研究发现,synV三倍体重排酵母中玉米黄质产量提升的菌株比例高达15%,玉米黄质产量提升幅度最高达到3.80倍。对玉米黄质产量提升的synV重排酵母进行基因型分析,发现一次染色体重排即可获得基因型多样化的酵母文库,包括非整倍体酵母... 

【文章来源】：天津大学天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：88 页

【学位级别】：硕士

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第 3 章 酵母交配型转换3.1 引言由于 HO 基因的缺失或突变，实验室酵母菌株的交配型通常是比较稳定的。以往转换酵母交配型的方法是构建含有 HO 基因的质粒，将质粒转化进入酵母中，利用 HO 核酸内切酶促进单倍体酵母菌株的交配型转换[58]，如图 3-1 所示。此外，可将 HO 基因置于半乳糖启动子控制下，实现酵母交配型的诱导型互变，但这种方法的转换效率并不高[14, 38, 59]。且利用此方法并不能转换二倍体酵母的交配型。另外，如果删除酵母菌株的 HMRa 和 HMRα 基因座，则通过上述方法并不能完成酵母交配型的转换[60]，如 synIII 酵母染色体[2]在合成时将 HMRa 和HMRα 基因座删除，故要想将 synIII 与其他的合成型酵母合并在一个酵母细胞中时，均需要转换其交配型。

.2 酵母交配型转换所需质粒的构建.2.1 gRNA 表达质粒的构建利用 CRISPR gRNA 设计软件对 20 bp 的前间隔序列（protospacers）进行，将20 bp protospacers设计在Ya或Yα区域之前，使前间隔区相邻基序（PAM MATa 或 MATα 处产生特定的双链缺口 DSB，如图 3-2 所示，从而使酿酒在有外源的 MATα 或 MATa 基因片段时发生同源重组，完成交配型的转换 NotI 限制性内切酶切割 gRNA 表达质粒 pNA0304 并进行凝胶回收。通过长 60 bp 含有 20 bp gRNA 片段的两个单链寡核苷酸链退火产生 MAT 基因 gRNA 盒，其中 20 bp gRNA 盒的两侧各连接了 20 bp 与 pNA0304 表达载otI 酶切位点处同源的序列，据此利用 Gibson 组装的方法将 20 bp gRNA 盒性的 pNA0304 表达载体进行连接。将连接产物转化进入大肠杆菌，待转化出来，提取质粒进行酶切验证及测序分析。


本文编号：2932833