重组SipoEXLX2增效蛋白的表达、纯化及特性研究

发布时间：2021-01-12 03:25

　　作为地球最丰富的生物质能源,木质纤维素可经纤维素酶降解为葡萄糖进而转化为生物乙醇等燃料,但由于木质纤维素高度复杂的结晶结构致使木质纤维素的酶解受到了阻碍。纤维素酶增效蛋白作为一种非水解性蛋白,已被认为是提高纤维素酶水解效率,减少酶载量的选择。本实验室克隆构建了一株来源于甘薯链霉菌的含增效蛋白基因的重组菌,SipoEXLX2为增效蛋白基因的表达产物。在前期纯化中未能得到单一条带的SipoEXLX2目的蛋白。因此,本文开展了SipoEXLX2增效蛋白的表达纯化、作用机理和协同纤维素酶降解碱处理水稻秸秆等工作,实验结果如下:通过重新构建质粒载体,在C-末端增加His标签,纯化得到了纯度大于90%,协同增效大于1倍的SipoEXLX2增效蛋白。经过诱导条件优化,SipoEXLX2蛋白在IPTG为1M,16℃诱导12h的条件下,目的蛋白上清中的表达量达到约35 mg/L。SipoEXLX2增效蛋白协同纤维素酶降解滤纸的影响因素和作用机理研究。SipoEXLX2增效蛋白协同纤维素酶的最佳协同条件是pH 4.8、温度50℃、250μg SipoEXLX2增效蛋白和0.06 FPU/g cellulo... 

【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２－１重组质粒的图谱??Ｆｉｇ．?２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇａｍ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??

?（ｃ）重组质粒??载体图谱如图２－１：与原重组质粒不同的是在ＰＥＴ２８ａ质粒的Ｃ－末端增加了一个Ｈｉｓ??标签。提取原Ｓｉｐｏｌ－ｐＥＴ２８ａ⑴－Ｅ．ｃｏｌｉ重组菌的ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增，回收扩增序列，通过??ＢａｍＨＩ和Ｘｈｏｌ对原始载体ｐＥＴ２８ａ和ＰＣＲ产物进行酶切，将获得的片段和载体通过Ｔ４??连接酶连接到载体骨架上。将连接产物转化至大肠杆菌ＤＨ５?ａ中。挑取阳性单克隆测序。??（２ＳＳ?．．?１８２｝?Ｒ?ＸｈＯｌ?；１Ｓ８｝??：??０＾１?｛８３６｝??７ｔａｇ（ｇｃｍｉｉ〇ｔｅａｄ？：｝??ｓｉｔｅ??图２－１重组质粒的图谱??Ｆｉｇ．?２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇａｍ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ??（ｄ）蛋白表达??１）将测序正确的质粒通过化学转化法转入ＢＬ２１?（Ｒｉｌ）（全式金）。??２）?挑取单克隆摇菌３７°Ｃ?２２０ｒ／ｍｉｎ培养８￣１２ｈ。将单克隆进行ＰＣＲ鉴定，并将鉴??定正确的菌液按照１％的接种量转接至１５０ｍＬＬＢ培养基中３７°Ｃ继续培养表达。??１８??

图２＿３葡萄糖标准曲线图??Ｆｉｇ．?２－３?Ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｇｌｕｃｏｓｅ??图２－３所示可知，ｙ＝?１．６１０８ｘ－?０．０９２０１，Ｒ２?＝?０．９９９，为葡萄糖标准曲线线性回归??方程，且线性关系较好。取每次测得样品的吸收值，代入相应的线性回归方程，从而获??得样品的还原糖含量。??２．１．１３纤维素酶增效活性的测定方法??增效测定方法与滤纸酶活力测定方法［８３］略有改动。其中所有酶活反应均为２?ｍｌ??反应体系。反应体系为滤纸?５０．０±０．５ｍｇ，０．０６ＦＰＵ／ｇｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，％ｏＥＸＬＸ２?蛋白?２５０ｕｇ，??余下步骤与滤纸纤维素酶活力测定相同，每组做三个平行试验。增效蛋白的增效活性由??公式２－１表不。??增效活性＝（（扣除空白的蛋白与酶共同作用所产还原糖的量／扣除空白的纤维素酶??单独水解产的还原糖量）－１）?＊１００％?（２－１）??增效蛋白协同纤维素酶降解滤纸的增效活性受纤维素酶酶载量和增效蛋白用量的??影响。通常，为了测试预处理的木质纤维素的酶解效率率或同时糖化和发酵（ＳＳＦ），??所用纤维素酶量大于５?ＦＰＵ／ｇ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ［８？８６］。但纤维素酶和细菌ｅｘｐａｎｓｉｎ之间的协同作??用，一般在低酶载量０．０１２－０．６?ＦＰＵ／ｇ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ条件下有明显的协同作用，如在纤维素酶??载量为０．６?ＦＰＵ／ｇ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ时，＆ＥＸＬＸ１协同纤维素酶降解滤纸时几乎没有增效作用［５４＼??因此在测定增效蛋白的协同活性时，纤维素酶载量应低于０．６?ＦＰＵ／ｇ?ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ。参考??伦ＥＸＬＸ１这类增效蛋白与纤维素酶协同时


本文编号：2972050