Trichoderma viride β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达、发酵优化及应用研究
发布时间：2021-02-08 10:34
低聚龙胆糖是葡萄糖单元通过β-1,6糖苷键连接而组成的功能性低聚糖,它是一种混合物,以龙胆二糖为主同时含有少量的龙胆三糖和龙胆四糖。低聚龙胆糖有着众多优良的生理功能,低热、低甜、低水活性,不能被人体的消化酶所降解。目前,被广泛的应用到巧克力、冰淇凌、咖啡、调味品、烘烤食品、饮料等产品当中。本研究将Trichoderma viride来源的β-葡糖糖苷酶基因bgl1连接到表达载体pPIC9K上,在Pichia pastoris KM71中表达,同时共表达二硫键异构酶pdi,成功地获得了能够高效分泌表达β-葡糖糖苷酶的重组Pichia pastoris菌株,并将其在3.6 L发酵罐中进行发酵优化。研究了重组β-葡糖糖苷酶的酶学性质,并优化了利用重组β-葡糖糖苷酶的转苷和逆水解活性来合成低聚龙胆糖的工艺条件。主要研究结果如下:（1）采用重叠PCR的方法从Trichoderma viride中获得β-葡萄糖苷酶的目的基因bgll,构建重组质粒pPIC9K-bgl1,整合到Pichia pastoris KM71中。为了帮助二硫键的形成从而提高蛋白折叠效率,共表达二硫键异构酶pdi,获得重组P....
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：47 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?（３－葡萄糖苷酶反应示意图??Ｆｉｇ．?１－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?Ｐ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ?ｒｅａｃｔｉｏｎ??
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活达到ＳＳＵ．ｍＬ／１。发酵上清液经．．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定，在７６ｋＤａ处出现一条明显的蛋白条??带，与理论的（３－葡萄糖苷酶的分子量相符，说明Ｐ－葡萄糖苷酶在ｉＰ／ｏ＾／ｗ．ｖ／ｗ／．ｖ?ＫＭ７１??中成功表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳如图３－３所示。??ＫＤａ?Ｍ?１??９７．２?ＦＢ７；??６“??４４．３?？??２９：夢１??，３?—Ｂ??图３－３．重组Ｐ－葡萄糖苷酶表达的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析??Ｍ：蛋白Ｍａｒｋｅｒ；?１：发酵上清??Ｆｉｇ．?３－３?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ?ｉｎ?Ｐｉｃｈｉａ?ｐａｓｔｏｒｉｓ?ＫＭ７１??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?Ｃｕｌｔｕｒｅ?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ??３丄２重组１＜；１＾７１／口１）１匚９１＜－／＾／＂卩卩１Ｒ遥粒?穑颍⒌墓菇?氨泶铮崳?７Ｗｃ／？ｏＡｒ願ｖ／ｒ／也ｐ－葡萄糖苷酶含有三对二硫键，当该ｐ－葡萄糖苷酶在毕赤酵母中??快速表达时，有可能形成折叠不完整的二硫键。为了帮助二硫键的形成从而提高蛋白折??１７??
【参考文献】：
期刊论文
[1]糖苷水解酶第3家族β-葡萄糖苷酶的研究进展[J]. 周林芳,江波,张涛,李淑华. 食品工业科技. 2017(14)
[2]重组毕赤酵母生产β-葡萄糖苷酶发酵条件初步研究[J]. 刘玲玲,吴丹,朱威,陈晟,陈坚,吴敬. 工业微生物. 2010 (05)
[3]β-葡萄糖苷酶高产菌株的选育及酶法转化葡萄糖生产龙胆低聚糖[J]. 朱婧,覃拥灵,陈桂光,张云开,刘演景,罗杰,梁智群. 食品与发酵工业. 2010(04)
[4]一株产胞外中性β-葡萄糖苷酶菌株的鉴定及酶学特性研究[J]. 陈红漫,赵璐,杨佳影. 食品科学. 2009(15)
[5]重组β-葡萄糖苷酶生产龙胆低聚糖的工艺条件优化[J]. 刘玲玲,朱松,朱婷,张敏,吴敬,陈坚. 微生物学报. 2009(05)
[6]β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展[J]. 韩笑,陈介南,王义强,何钢,刘海波,谭力. 生物技术通报. 2008(03)
[7]毕赤酵母工程菌发酵条件的优化[J]. 窦烨,王清路,李俏俏. 食品工业科技. 2008(06)
[8]β-葡萄糖苷酶产生菌的选育及其性质研究[J]. 朱凤妹,李军,杜彬,刘长江. 安徽农业科学. 2008(03)
[9]黑曲霉β-葡萄糖苷酶的研究进展[J]. 闫会平,陈士华,吴兴泉. 纤维素科学与技术. 2007(01)
[10]β-葡萄糖苷酶的研究及应用进展[J]. 潘利华,罗建平. 食品科学. 2006(12)
硕士论文
[1]嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶的分子改造及高效表达[D]. 孙烨橙.江南大学 2016
[2]Streptomyces sp. FA1木聚糖酶在毕赤酵母中的表达、发酵优化及应用研究[D]. 徐洋.江南大学 2016
[3]Fusarium oxysporum磷脂酶B在毕赤酵母中的重组表达、发酵及应用研究[D]. 吉得宁.江南大学 2016
[4]二硫键异构酶过表达对家蚕乙酰胆碱酯酶在毕赤酵母中表达的作用研究[D]. 卢临萍.华南农业大学 2016
[5]黑曲霉α-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的高效表达研究[D]. 刘旭.江南大学 2013
[6]重组毕赤酵母表达β-葡萄糖苷酶的发酵优化[D]. 张建鸿.江南大学 2012
[7]β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖制备低聚龙胆糖的研究[D]. 刘玲玲.江南大学 2009
[8]重组毕赤酵母高密度发酵生产碱性果胶酶的策略研究[D]. 王芸.江南大学 2008
本文编号：3023787
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：47 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?（３－葡萄糖苷酶反应示意图??Ｆｉｇ．?１－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?Ｐ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ?ｒｅａｃｔｉｏｎ??
５００??２ｓ。ｍ??图３－２重组质粒ｐＰＩＣ９Ｋ－６ｇ／／双酶切验证??Ｍ：核酸分子量标准；１：?ｐＰＩＣ９Ｋ－／）ｉ？／／双酶切样品??Ｆｉｇ．?３－２?Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＰＩＣ９Ｋ－＾ｇ／７??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ；?Ｉ：?ｐＰｌＣ９Ｋ－ｂｇｌＩ?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?Ｎｏｔ?Ｉ?ａｎｄ?ＳｎａＢ?Ｉ??将经鉴定正确的重组表达载体ｐＰＩＣ９Ｋ－ｋ／／用Ｉ单酶切线性化，胶回收纯化后，??电转至Ｐ／ｃ／ｚ／ａｐａｙ／ｏｒ／ｓ?ＫＭ７１感受态细胞中，然后涂布到ＭＤ平板上进行初步筛选，初??步筛选后用不同浓度的Ｇ４１８平板进行复筛，培养２－３?ｄ后从Ｇ４１８相对浓度较高的平板??上挑取单菌落到１０?ｍＬ?ＹＰＤ液体培养基中培养２４?ｈ，取２．５?ｍＬ菌液转接到５０?ｍＬ??ＢＭＧＹ培养基培养２４?ｈ，再转入２５?ｍＬ?ＢＭＭＹ液体培养基中培养。在摇瓶中经过甲醇??诱导，卩－葡萄糖苷酶成功的表达并分泌到发酵液中。在诱导１２０?ｈ时，Ｐ－葡萄糖苷酶酶??活达到ＳＳＵ．ｍＬ／１。发酵上清液经．．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定，在７６ｋＤａ处出现一条明显的蛋白条??带
活达到ＳＳＵ．ｍＬ／１。发酵上清液经．．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定，在７６ｋＤａ处出现一条明显的蛋白条??带，与理论的（３－葡萄糖苷酶的分子量相符，说明Ｐ－葡萄糖苷酶在ｉＰ／ｏ＾／ｗ．ｖ／ｗ／．ｖ?ＫＭ７１??中成功表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳如图３－３所示。??ＫＤａ?Ｍ?１??９７．２?ＦＢ７；??６“??４４．３?？??２９：夢１??，３?—Ｂ??图３－３．重组Ｐ－葡萄糖苷酶表达的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析??Ｍ：蛋白Ｍａｒｋｅｒ；?１：发酵上清??Ｆｉｇ．?３－３?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ?ｉｎ?Ｐｉｃｈｉａ?ｐａｓｔｏｒｉｓ?ＫＭ７１??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?Ｃｕｌｔｕｒｅ?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ??３丄２重组１＜；１＾７１／口１）１匚９１＜－／＾／＂卩卩１Ｒ遥粒?穑颍⒌墓菇?氨泶铮崳?７Ｗｃ／？ｏＡｒ願ｖ／ｒ／也ｐ－葡萄糖苷酶含有三对二硫键，当该ｐ－葡萄糖苷酶在毕赤酵母中??快速表达时，有可能形成折叠不完整的二硫键。为了帮助二硫键的形成从而提高蛋白折??１７??
【参考文献】：
期刊论文
[1]糖苷水解酶第3家族β-葡萄糖苷酶的研究进展[J]. 周林芳,江波,张涛,李淑华. 食品工业科技. 2017(14)
[2]重组毕赤酵母生产β-葡萄糖苷酶发酵条件初步研究[J]. 刘玲玲,吴丹,朱威,陈晟,陈坚,吴敬. 工业微生物. 2010 (05)
[3]β-葡萄糖苷酶高产菌株的选育及酶法转化葡萄糖生产龙胆低聚糖[J]. 朱婧,覃拥灵,陈桂光,张云开,刘演景,罗杰,梁智群. 食品与发酵工业. 2010(04)
[4]一株产胞外中性β-葡萄糖苷酶菌株的鉴定及酶学特性研究[J]. 陈红漫,赵璐,杨佳影. 食品科学. 2009(15)
[5]重组β-葡萄糖苷酶生产龙胆低聚糖的工艺条件优化[J]. 刘玲玲,朱松,朱婷,张敏,吴敬,陈坚. 微生物学报. 2009(05)
[6]β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达研究进展[J]. 韩笑,陈介南,王义强,何钢,刘海波,谭力. 生物技术通报. 2008(03)
[7]毕赤酵母工程菌发酵条件的优化[J]. 窦烨,王清路,李俏俏. 食品工业科技. 2008(06)
[8]β-葡萄糖苷酶产生菌的选育及其性质研究[J]. 朱凤妹,李军,杜彬,刘长江. 安徽农业科学. 2008(03)
[9]黑曲霉β-葡萄糖苷酶的研究进展[J]. 闫会平,陈士华,吴兴泉. 纤维素科学与技术. 2007(01)
[10]β-葡萄糖苷酶的研究及应用进展[J]. 潘利华,罗建平. 食品科学. 2006(12)
硕士论文
[1]嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶的分子改造及高效表达[D]. 孙烨橙.江南大学 2016
[2]Streptomyces sp. FA1木聚糖酶在毕赤酵母中的表达、发酵优化及应用研究[D]. 徐洋.江南大学 2016
[3]Fusarium oxysporum磷脂酶B在毕赤酵母中的重组表达、发酵及应用研究[D]. 吉得宁.江南大学 2016
[4]二硫键异构酶过表达对家蚕乙酰胆碱酯酶在毕赤酵母中表达的作用研究[D]. 卢临萍.华南农业大学 2016
[5]黑曲霉α-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的高效表达研究[D]. 刘旭.江南大学 2013
[6]重组毕赤酵母表达β-葡萄糖苷酶的发酵优化[D]. 张建鸿.江南大学 2012
[7]β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖制备低聚龙胆糖的研究[D]. 刘玲玲.江南大学 2009
[8]重组毕赤酵母高密度发酵生产碱性果胶酶的策略研究[D]. 王芸.江南大学 2008
本文编号：3023787
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