新颖木质纤维素降解酶的宏基因组学挖掘及其在纤维二糖酸生产中的作用
发布时间：2021-02-23 20:15
利用储量丰富且可再生的食品和农业废弃物生产生物基能源和化学品具有重要的经济、环保价值。现有生产工艺中的主要瓶颈是缺乏高效的木质纤维素降解酶和高效、经济的产品生产工艺。木质纤维素降解酶主要包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和木质素降解酶,其中果胶酶,长期以来被认为是一类不重要的辅酶,被严重低估。此外,纤维二糖酸,是一种高附加值但目前产能较低的有机酸,具有重要经济价值。因此,为了发掘高效、新颖木质纤维素降解酶及降低纤维二糖酸生产工艺成本,本研究主要通过构建具有高效木质纤维素降解能力的堆肥生境并进行宏基因组学分析,挖掘新颖木质纤维素降解酶并研究其在纤维二糖酸生产中的作用,并进一步探索统合生物加工生产纤维二糖酸中预处理工艺。论文的主要研究内容和结果如下:1.高效木质纤维素降解堆肥生境的构建及宏基因组学分析通过定向富集培养技术,构建了具有高效木质纤维素降解能力的堆肥体系（apple pomace-adapted compost microbial community,APACMC）。在富集培养过程中,堆肥体系的最高温度达68℃,呈现出堆肥典型的升温期、高温期、降温期和腐熟期四个阶段;16S r D...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：204 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中英文缩写对照表
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 木质纤维素生物质
1.1.1 木质纤维素生物质的基本结构
1.1.2 果胶在木质纤维素中的作用
1.1.3 木质纤维素生物质能源生产的瓶颈
1.2 木质纤维素降解酶
1.2.1 纤维素水解酶
1.2.2 裂解性多糖单加氧酶
1.2.3 纤维二糖脱氢酶
1.2.4 半纤维素酶
1.2.5 果胶酶
1.2.6 木质素降解酶——漆酶
1.3 宏基因组学技术在挖掘木质纤维素降解酶中的应用
1.3.1 宏基因组学
1.3.2 木质纤维素降解酶的宏基因组挖掘
1.4 统合生物加工生产纤维二糖酸
1.4.1 纤维二糖酸
1.4.2 Neurospora crassa工程菌
1.4.3 LPMO、CDH、漆酶、GMC氧化还原酶、木质素与纤维素之间的关系
1.5 本文研究意义及主要研究内容
1.5.1 研究意义
1.5.2 研究内容及技术路线图
第二章 木质纤维素降解堆肥生境的构建及宏基因组学分析
2.1 试验材料与设备
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要试剂及耗材
2.1.3 主要仪器与设备
2.2 试验方法
2.2.1 苹果渣生物质降解微生物在堆肥环境中的富集
2.2.2 堆肥的物理化学性质分析
2.2.3 16S rDNA基因高通量测序和物种系统分类
2.2.4 宏基因组测序,de novo序列组装和开放阅读框预测
2.2.5 序列提交
2.3 结果与讨论
2.3.1 堆肥进程中理化性质的变化
2.3.2 堆肥进程中微生物群落结构的变化
2.3.3 APACMC宏基因组中的微生物多样性分析
2.3.4 APACMC宏基因组中预测基因的功能基因分类
2.3.5 APACMC宏基因组中碳水化合物活性酶的多样性、丰度和微生物来源
2.4 小结
第三章 纤维素降解酶、半纤维素降解酶和木质素降解酶的宏基因组学挖掘
3.1 试验材料与设备
3.1.1 试验材料
3.1.2 主要试剂及耗材
3.1.3 主要仪器与设备
3.2 试验方法
3.2.1 木质纤维素生物质降解微生物在堆肥生境中的富集效果的评判
3.2.2 纤维素酶活和半纤维素酶活的测定
3.2.3 木质纤维素降解酶基因的注释
3.2.4 木质素降解基因的准确注释
3.2.5 特定的纤维素、半纤维素和木质素降解基因:注释及系统发育树分析
3.3 结果与讨论
3.3.1 富集的微生物纤维素降解能力的初级评判
3.3.2 纤维素酶活和半纤维素酶活的测定
3.3.3 APACMC宏基因组中木质纤维素降解微生物组成分析
3.3.4 APACMC宏基因组中木质纤维素降解代谢潜能分析
3.3.5 木质纤维素降解酶的挖掘
3.3.6 木质纤维素降解微生物的挖掘
3.3.7 需重点关注的木质纤维素降解酶及微生物
3.4 小结
第四章 宏基因组学挖掘果胶降解菌、果胶酶及嗜热果胶酶的分离、纯化和表征
4.1 试验材料与设备
4.1.1 试验材料
4.1.2 主要试剂及耗材
4.1.3 主要仪器设备
4.2 试验方法
4.2.1 果胶降解微生物在堆肥生境中的富集效果的评判
4.2.2 特定果胶酶降解基因:基因注释和系统发育分析
4.2.3 果胶酶活的测定
4.2.4 嗜热果胶降解微生物的筛选分离
4.2.5 嗜热果胶降解微生物的鉴定
4.2.6 编码果胶酶基因序列的克隆、验证及测序
4.2.7 编码果胶酶的氨基酸序列比对、生物信息学分析及其三维结构模拟
4.2.8 果胶酶的分离纯化
4.2.9 温度、pH、金属离子和化学试剂对酶的影响
4.2.10 底物特异性和酶促动力学参数的测定
4.3 结果与讨论
4.3.1 富集微生物的果胶降解能力的初级评判
4.3.2 参与果胶降解的特定COG功能分类分析
4.3.3 果胶降解酶的挖掘
4.3.4 果胶降解微生物的挖掘
4.3.5 嗜热果胶降解微生物的分离
4.3.6 嗜热细菌来源的果胶降解酶的基因克隆与测序
4.3.7 果胶酸裂解酶的纯化及分子量的确定
4.3.8 果胶酸裂解酶BsPel-Z10 的酶学特性
4.3.9 金属离子和化学试剂对BsPel-Z10 酶活的影响
4.3.10 BsPel-Z10 的底物特异性和酶动力学参数测定
4.4 小结
第五章 五个宏基因组来源的新颖木质纤维素降解酶的异源表达及分析
5.1 试验材料与设备
5.1.1 试验载体与菌株
5.1.2 工具酶和试剂盒
5.1.3 主要试剂及培养基
5.1.4 主要仪器及设备
5.2 试验方法
5.2.1 新颖木质纤维素降解酶基因的验证及筛选
5.2.2 新颖木质纤维素降解酶基因的分析及合成
5.2.3 重组质粒的构建及验证
5.2.4 基因工程菌E.coli BL21 的构建及鉴定
5.2.5 重组工程菌诱导表达获得重组酶
5.2.6 重组酶的分离纯化
5.2.7 重组酶的蛋白电泳SDS-PAGE检测
5.2.8 LPMO与铜离子的结合
5.2.9 重组酶的酶活测定
5.2.10 重组酶蛋白含量测定
5.2.11 重组酶系统发育分析、蛋白结构的同源建模与分析
5.3 结果与讨论
5.3.1 LPMO10-297291的序列分析
5.3.2 CE15-3258的序列分析
5.3.3 Lac-4805的序列分析
5.3.4 GH43-5749的序列分析
5.3.5 PL11-18811的序列分析
5.3.6 重组质粒、基因工程菌的构建及验证
5.3.7 重组酶的诱导表达、纯化及酶活测定
5.3.8 重组酶的同源建模及结构和催化活性位点分析
5.4 小结
第六章 漆酶、纤维二糖脱氢酶和木质素在纤维二糖酸生产中的协同作用
6.1 试验材料与设备
6.1.1 试验菌株
6.1.2 主要试剂、耗材及培养基
6.1.3 主要仪器及设备
6.2 试验材料及方法
6.2.1 N.crassa F5ΔΔΔ和 HL10 种子的制备
6.2.2 N.crassa F5ΔΔΔ和 HL10 体内发酵试验
6.2.3 纤维二糖脱氢酶的制备及纯化
6.2.4 漆酶的制备及纯化
6.2.5 纤维二糖脱氢酶和漆酶酶活及浓度的测定
6.2.6 小麦秸秆原料的制备
6.2.7 酶解木质素的制备
6.2.8 CDH-漆酶无细胞体系将纤维二糖转化为纤维二糖酸的体外试验
6.2.9 纤维二糖酸标品的制备及标定
6.2.10 纤维二糖、纤维二糖酸、葡萄糖和葡萄糖酸浓度的测定
6.2.11 木质素对CDH和漆酶酶活的影响
6.2.12 木质纤维素组分测定
6.2.13 停流光谱仪监测CDH与漆酶之间的电子传递
6.2.14 电子顺磁共振光谱技术测定木质素自由基的形成及消耗
6.2.15 数据处理
6.3 结果与讨论
6.3.1 CDH、漆酶酶活及纤维二糖酸标品浓度
6.3.2 外源添加氧化还原介体对N.crassa HL10 高产纤维二糖酸的必要性
6.3.3 N.crassa HL10 直接从Avicel和小麦秸秆中生产纤维二糖酸的比较
6.3.4 木质素对N.crassa HL10将Avicel转化为纤维二糖酸的影响
6.3.5 木质素对CDH-漆酶无细胞体系将纤维二糖转化为纤维二糖酸的影响
6.3.6 木质素对CDH和漆酶酶活的影响
6.3.7 CDH-木质素-漆酶体系的潜在机制
6.3.8 EPR监测木质素自由基产生及消耗
6.3.9 停流光谱仪监测CDH与漆酶之间的电子传递
6.4 小结
第七章 工程菌N.crassa直接从小麦秸秆中统合生产纤维二糖酸
7.1 试验材料与设备
7.1.1 试验菌株
7.1.2 主要试剂、耗材及培养基
7.1.3 主要仪器设备
7.2 试验方法
7.2.1 小麦秸秆的三种预处理
7.2.2 三种从预处理小麦秸秆木质素的制备
7.2.3 木质纤维素组分测定及木质素的测定
7.2.4 CDH和漆酶的制备、纯化及酶活测定
7.2.5 N.crassa HL10 种子的制备
7.2.6 不同预处理小麦秸秆的N.crassa HL10 发酵
7.2.7 三种木质素对N.crassa HL10 生产纤维二糖酸的影响
7.2.8 三种木质素对CDH-漆酶无细胞体系生产纤维二糖酸的影响
7.2.9 纤维二糖和纤维二糖酸的检测
7.2.10 木质素和酚类物质含量测定
7.2.11 三种预处理小麦秸秆及其相应木质素的傅里叶红外光谱
7.2.12 三种预处理小麦秸秆的X射线衍射分析
7.2.13 凝胶渗透色谱对三种木质素分子量的测定
7.2.14 香草醛、丁香醛和阿魏酸对CDH-漆酶无细胞体系产纤维二糖酸的影响
7.2.15 数据处理
7.3 结果与讨论
7.3.1 不同预处理对小麦秸秆中各组分的影响
7.3.2 三种预处理小麦秸秆统合生物加工生产纤维二糖酸能力比较
7.3.3 三种木质素对N.crassa HL10以Avicel为底物生产纤维二糖酸的影响
7.3.4 三种木质素对CDH-漆酶无细胞体系生产纤维二糖酸的影响
7.3.5 三种预处理小麦秸秆及其制备的相应木质素的FTIR分析
7.3.6 三种预处理小麦秸秆的XRD特性
7.3.7 三种木质素的分子大小及分布比较
7.3.8 香草醛、丁香醛和阿魏酸在CDH-漆酶无细胞体系生产中纤维二糖酸的作用
7.3.9 N.crassa HL10 从碱预处理小麦秸秆中统合生产纤维二糖酸工艺的初步构建
7.4 小结
第八章 结论、创新点与展望
8.1 结论
8.2 创新点
8.3 展望
参考文献
致谢
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]Actinosynnema mirum DSM43827溶解性多糖单加氧酶的异源表达和酶学性质表征[J]. 施贤卫,张伟涛,张小飞,杨广宇,冯雁. 中国生物工程杂志. 2014(07)
博士论文
[1]堆肥过程N2O减排控制与木质纤维素降解微生物学机理研究[D]. 王成.浙江大学 2014
[2]木质纤维素降解菌产糖特性及作用机制[D]. 高灵芳.哈尔滨工业大学 2013
[3]果胶酶基因的克隆表达及其在小尾寒羊瘤胃环境中的多样性分析[D]. 苑鹏.中国农业科学院 2012
硕士论文
[1]真菌果胶酶性质分析及分子改良[D]. 潘霞.中国农业科学院 2014
[2]木质素降解过程中纤维二糖脱氢酶和漆酶协同作用的初步研究[D]. 李振华.山东大学 2009
本文编号：3048166
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：204 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中英文缩写对照表
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 木质纤维素生物质
1.1.1 木质纤维素生物质的基本结构
1.1.2 果胶在木质纤维素中的作用
1.1.3 木质纤维素生物质能源生产的瓶颈
1.2 木质纤维素降解酶
1.2.1 纤维素水解酶
1.2.2 裂解性多糖单加氧酶
1.2.3 纤维二糖脱氢酶
1.2.4 半纤维素酶
1.2.5 果胶酶
1.2.6 木质素降解酶——漆酶
1.3 宏基因组学技术在挖掘木质纤维素降解酶中的应用
1.3.1 宏基因组学
1.3.2 木质纤维素降解酶的宏基因组挖掘
1.4 统合生物加工生产纤维二糖酸
1.4.1 纤维二糖酸
1.4.2 Neurospora crassa工程菌
1.4.3 LPMO、CDH、漆酶、GMC氧化还原酶、木质素与纤维素之间的关系
1.5 本文研究意义及主要研究内容
1.5.1 研究意义
1.5.2 研究内容及技术路线图
第二章 木质纤维素降解堆肥生境的构建及宏基因组学分析
2.1 试验材料与设备
2.1.1 试验材料
2.1.2 主要试剂及耗材
2.1.3 主要仪器与设备
2.2 试验方法
2.2.1 苹果渣生物质降解微生物在堆肥环境中的富集
2.2.2 堆肥的物理化学性质分析
2.2.3 16S rDNA基因高通量测序和物种系统分类
2.2.4 宏基因组测序,de novo序列组装和开放阅读框预测
2.2.5 序列提交
2.3 结果与讨论
2.3.1 堆肥进程中理化性质的变化
2.3.2 堆肥进程中微生物群落结构的变化
2.3.3 APACMC宏基因组中的微生物多样性分析
2.3.4 APACMC宏基因组中预测基因的功能基因分类
2.3.5 APACMC宏基因组中碳水化合物活性酶的多样性、丰度和微生物来源
2.4 小结
第三章 纤维素降解酶、半纤维素降解酶和木质素降解酶的宏基因组学挖掘
3.1 试验材料与设备
3.1.1 试验材料
3.1.2 主要试剂及耗材
3.1.3 主要仪器与设备
3.2 试验方法
3.2.1 木质纤维素生物质降解微生物在堆肥生境中的富集效果的评判
3.2.2 纤维素酶活和半纤维素酶活的测定
3.2.3 木质纤维素降解酶基因的注释
3.2.4 木质素降解基因的准确注释
3.2.5 特定的纤维素、半纤维素和木质素降解基因:注释及系统发育树分析
3.3 结果与讨论
3.3.1 富集的微生物纤维素降解能力的初级评判
3.3.2 纤维素酶活和半纤维素酶活的测定
3.3.3 APACMC宏基因组中木质纤维素降解微生物组成分析
3.3.4 APACMC宏基因组中木质纤维素降解代谢潜能分析
3.3.5 木质纤维素降解酶的挖掘
3.3.6 木质纤维素降解微生物的挖掘
3.3.7 需重点关注的木质纤维素降解酶及微生物
3.4 小结
第四章 宏基因组学挖掘果胶降解菌、果胶酶及嗜热果胶酶的分离、纯化和表征
4.1 试验材料与设备
4.1.1 试验材料
4.1.2 主要试剂及耗材
4.1.3 主要仪器设备
4.2 试验方法
4.2.1 果胶降解微生物在堆肥生境中的富集效果的评判
4.2.2 特定果胶酶降解基因:基因注释和系统发育分析
4.2.3 果胶酶活的测定
4.2.4 嗜热果胶降解微生物的筛选分离
4.2.5 嗜热果胶降解微生物的鉴定
4.2.6 编码果胶酶基因序列的克隆、验证及测序
4.2.7 编码果胶酶的氨基酸序列比对、生物信息学分析及其三维结构模拟
4.2.8 果胶酶的分离纯化
4.2.9 温度、pH、金属离子和化学试剂对酶的影响
4.2.10 底物特异性和酶促动力学参数的测定
4.3 结果与讨论
4.3.1 富集微生物的果胶降解能力的初级评判
4.3.2 参与果胶降解的特定COG功能分类分析
4.3.3 果胶降解酶的挖掘
4.3.4 果胶降解微生物的挖掘
4.3.5 嗜热果胶降解微生物的分离
4.3.6 嗜热细菌来源的果胶降解酶的基因克隆与测序
4.3.7 果胶酸裂解酶的纯化及分子量的确定
4.3.8 果胶酸裂解酶BsPel-Z10 的酶学特性
4.3.9 金属离子和化学试剂对BsPel-Z10 酶活的影响
4.3.10 BsPel-Z10 的底物特异性和酶动力学参数测定
4.4 小结
第五章 五个宏基因组来源的新颖木质纤维素降解酶的异源表达及分析
5.1 试验材料与设备
5.1.1 试验载体与菌株
5.1.2 工具酶和试剂盒
5.1.3 主要试剂及培养基
5.1.4 主要仪器及设备
5.2 试验方法
5.2.1 新颖木质纤维素降解酶基因的验证及筛选
5.2.2 新颖木质纤维素降解酶基因的分析及合成
5.2.3 重组质粒的构建及验证
5.2.4 基因工程菌E.coli BL21 的构建及鉴定
5.2.5 重组工程菌诱导表达获得重组酶
5.2.6 重组酶的分离纯化
5.2.7 重组酶的蛋白电泳SDS-PAGE检测
5.2.8 LPMO与铜离子的结合
5.2.9 重组酶的酶活测定
5.2.10 重组酶蛋白含量测定
5.2.11 重组酶系统发育分析、蛋白结构的同源建模与分析
5.3 结果与讨论
5.3.1 LPMO10-297291的序列分析
5.3.2 CE15-3258的序列分析
5.3.3 Lac-4805的序列分析
5.3.4 GH43-5749的序列分析
5.3.5 PL11-18811的序列分析
5.3.6 重组质粒、基因工程菌的构建及验证
5.3.7 重组酶的诱导表达、纯化及酶活测定
5.3.8 重组酶的同源建模及结构和催化活性位点分析
5.4 小结
第六章 漆酶、纤维二糖脱氢酶和木质素在纤维二糖酸生产中的协同作用
6.1 试验材料与设备
6.1.1 试验菌株
6.1.2 主要试剂、耗材及培养基
6.1.3 主要仪器及设备
6.2 试验材料及方法
6.2.1 N.crassa F5ΔΔΔ和 HL10 种子的制备
6.2.2 N.crassa F5ΔΔΔ和 HL10 体内发酵试验
6.2.3 纤维二糖脱氢酶的制备及纯化
6.2.4 漆酶的制备及纯化
6.2.5 纤维二糖脱氢酶和漆酶酶活及浓度的测定
6.2.6 小麦秸秆原料的制备
6.2.7 酶解木质素的制备
6.2.8 CDH-漆酶无细胞体系将纤维二糖转化为纤维二糖酸的体外试验
6.2.9 纤维二糖酸标品的制备及标定
6.2.10 纤维二糖、纤维二糖酸、葡萄糖和葡萄糖酸浓度的测定
6.2.11 木质素对CDH和漆酶酶活的影响
6.2.12 木质纤维素组分测定
6.2.13 停流光谱仪监测CDH与漆酶之间的电子传递
6.2.14 电子顺磁共振光谱技术测定木质素自由基的形成及消耗
6.2.15 数据处理
6.3 结果与讨论
6.3.1 CDH、漆酶酶活及纤维二糖酸标品浓度
6.3.2 外源添加氧化还原介体对N.crassa HL10 高产纤维二糖酸的必要性
6.3.3 N.crassa HL10 直接从Avicel和小麦秸秆中生产纤维二糖酸的比较
6.3.4 木质素对N.crassa HL10将Avicel转化为纤维二糖酸的影响
6.3.5 木质素对CDH-漆酶无细胞体系将纤维二糖转化为纤维二糖酸的影响
6.3.6 木质素对CDH和漆酶酶活的影响
6.3.7 CDH-木质素-漆酶体系的潜在机制
6.3.8 EPR监测木质素自由基产生及消耗
6.3.9 停流光谱仪监测CDH与漆酶之间的电子传递
6.4 小结
第七章 工程菌N.crassa直接从小麦秸秆中统合生产纤维二糖酸
7.1 试验材料与设备
7.1.1 试验菌株
7.1.2 主要试剂、耗材及培养基
7.1.3 主要仪器设备
7.2 试验方法
7.2.1 小麦秸秆的三种预处理
7.2.2 三种从预处理小麦秸秆木质素的制备
7.2.3 木质纤维素组分测定及木质素的测定
7.2.4 CDH和漆酶的制备、纯化及酶活测定
7.2.5 N.crassa HL10 种子的制备
7.2.6 不同预处理小麦秸秆的N.crassa HL10 发酵
7.2.7 三种木质素对N.crassa HL10 生产纤维二糖酸的影响
7.2.8 三种木质素对CDH-漆酶无细胞体系生产纤维二糖酸的影响
7.2.9 纤维二糖和纤维二糖酸的检测
7.2.10 木质素和酚类物质含量测定
7.2.11 三种预处理小麦秸秆及其相应木质素的傅里叶红外光谱
7.2.12 三种预处理小麦秸秆的X射线衍射分析
7.2.13 凝胶渗透色谱对三种木质素分子量的测定
7.2.14 香草醛、丁香醛和阿魏酸对CDH-漆酶无细胞体系产纤维二糖酸的影响
7.2.15 数据处理
7.3 结果与讨论
7.3.1 不同预处理对小麦秸秆中各组分的影响
7.3.2 三种预处理小麦秸秆统合生物加工生产纤维二糖酸能力比较
7.3.3 三种木质素对N.crassa HL10以Avicel为底物生产纤维二糖酸的影响
7.3.4 三种木质素对CDH-漆酶无细胞体系生产纤维二糖酸的影响
7.3.5 三种预处理小麦秸秆及其制备的相应木质素的FTIR分析
7.3.6 三种预处理小麦秸秆的XRD特性
7.3.7 三种木质素的分子大小及分布比较
7.3.8 香草醛、丁香醛和阿魏酸在CDH-漆酶无细胞体系生产中纤维二糖酸的作用
7.3.9 N.crassa HL10 从碱预处理小麦秸秆中统合生产纤维二糖酸工艺的初步构建
7.4 小结
第八章 结论、创新点与展望
8.1 结论
8.2 创新点
8.3 展望
参考文献
致谢
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]Actinosynnema mirum DSM43827溶解性多糖单加氧酶的异源表达和酶学性质表征[J]. 施贤卫,张伟涛,张小飞,杨广宇,冯雁. 中国生物工程杂志. 2014(07)
博士论文
[1]堆肥过程N2O减排控制与木质纤维素降解微生物学机理研究[D]. 王成.浙江大学 2014
[2]木质纤维素降解菌产糖特性及作用机制[D]. 高灵芳.哈尔滨工业大学 2013
[3]果胶酶基因的克隆表达及其在小尾寒羊瘤胃环境中的多样性分析[D]. 苑鹏.中国农业科学院 2012
硕士论文
[1]真菌果胶酶性质分析及分子改良[D]. 潘霞.中国农业科学院 2014
[2]木质素降解过程中纤维二糖脱氢酶和漆酶协同作用的初步研究[D]. 李振华.山东大学 2009
本文编号：3048166
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3048166.html
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