代谢工程改造大肠杆菌制备尿苷

发布时间：2021-03-07 18:33

　　尿苷作为抗病毒抗肿瘤药物的中间体,具有极其重要的医药价值,已广泛应用于医药行业。微生物发酵法生产尿苷具有条件温和,操作简单,易操作等优点,是工业化生产尿苷的理想方法,高产尿苷的优良菌种构建是发酵法生产的前提条件。本研究采用CRISPR/Cas 9介导的基因编辑技术对野生型大肠杆菌Escherichia coli W3110进行系统的代谢工程改造,构建尿苷高产菌株。首先,将Bacillus subtilis A260的嘧啶核苷操纵子基因整合至E.coli W3110基因组上,构建了菌株UR1。摇瓶发酵结果显示,菌株UR1的发酵液中尿苷的浓度呈现先升高后下降的趋势,然而副产物尿嘧啶在整个发酵周期不断积累;发酵32 h,尿苷产量为3g/L,尿嘧啶产量为4.5g/L。其次,为了减少副产物尿嘧啶的积累,阻断了尿苷的降解,敲除与尿苷分解代谢相关的基因（udp,udk,rihA/B/C）,构建菌UR2-5。摇瓶发酵结果显示,尿苷产量为7.8 g/L,与菌株UR1相比提高了 136%,但副产物尿嘧啶仍有少量积累,产量为0.6 g/L。最后,为了进一步增加尿苷的积累量,对尿苷合成的前体物质氨甲酰磷酸,天... 

【文章来源】：天津科技大学天津市

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

咯暄操纵子的结构

????合成尿苷最重要的前体物质有三种：氨甲酰磷酸、天冬氨酸和ＰＲＰＰ。??氨甲酰磷酸的合成主要是由氨甲酰憐酸合成酶催化完成的，氨甲酰磷酸合成酶是??尿苷合成途径的第一步反应，是尿苷合成的限速步骤，大肠杆菌自身的氨甲酰磷酸合??成酶受到多种因素的严格调控。之前实验通过整合解除反馈调节的氨甲酰磷酸合成酶??的突变体的操纵子，使野生型的大肠杆菌具备了积累尿苷的能力。探究过表达氨甲酰??磷酸合成酶对尿苷合成的影响。??天冬氨酸参与尿苷合成的第二步反应，在天冬氨酸转氨甲酰酶作用下同氨甲酰磷??酸合成氨甲酰天冬氨酸。天冬氨酸还是多种氨基酸如苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和赖??氨酸的前体物。探宄切断天冬氨酸到高丝氨酸的代谢途径对尿苷合成的影响，即敲除??／／７ｒ／ｌ?基因。??ＰＲＰＰ是尿苷从头合成的关键前体物，胞内ＰＲＰＰ的浓度直接影响尿苷的生成，??并且由于ＰＲＰＰ同时受嘧啶核苷、嘌呤核苷、色氨酸的调控，其胞内浓度一般较低，??因此ＰＲＰＰ的量是尿苷合成的一个重要的限制因素。ＰＲＰＰ合成酶（由基因编码）??是ＰＲＰＰ合成的关键酶，探宄过表达ＰＲＰＰ合成酶对尿苷合成的影响。??１．６．３本论文的技术路线??本论文的技术路线见图１－７??

?ｊ?图３．１生物体内嘧啶核苷的从头合成途径??Ｆｉｇ．?３－１?Ｄｅ?ｎｏｖｏ?ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ??：Ｕ）??

【参考文献】：
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硕士论文
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本文编号：3069600