ω-转氨酶ArATA分子改造及合成手性萘乙胺的研究

发布时间：2021-03-26 21:03

　　(R)-1-（1-萘基）乙胺是合成拟钙剂药物盐酸西那卡塞的关键手性中间体,生物合成（R）-1-（1-萘基）乙胺的方法更加绿色环保,因而受到越来越多的关注。其中,ω-转氨酶（ω-transaminase）不对称还原前手性酮制备手性胺具有很多优势。本研究发现节杆菌属（Arthrobacter sp.KNK168）来源的ω-转氨酶ArATA可以不对称还原1-萘乙酮合成（R）-1-（1-萘基）乙胺,且具有良好的立体选择性（99%,R）,但其催化活力较低,难以实现工业化应用。因此,通过分子改造提高ArATA对1-萘乙酮的催化活力,主要研究内容和结果如下:采用随机突变和半理性设计相结合的策略。一方面,通过易错PCR构建随机突变文库,同时建立适用于1-萘乙酮为底物的ω-转氨酶高通量筛选方法,筛选到活力提升的突变体F225M、G136I、C281I和T282S;另一方面,根据晶体结构（PDB:3WWI）进行底物对接分析,通过对底物结合口袋中16个位点进行保守性分析,发现V69、W156、W192、G224和A284高度保守。对剩余11个位点进行丙氨酸扫描并对G136、V199和S223点进行定点饱和突... 

【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

(R)-1-(1-萘基)乙胺用于合成盐酸西那卡塞Figure1-2(R)-(+)-1-(1-naphthyl)ethylamineusedinthesynthesisofcinacalcethydrochloride

技术路线

江南大学硕士学位论文18第三章结果与讨论3.1转氨酶库的筛选3.1.1重组转氨酶的构建根据文献报道，使用ω-转氨酶作为生物催化剂不对称合成手性胺是一种广泛应用的制备方法，因此为了制备光学纯(R)-1-(1-萘基)乙胺，选择R-选择性ω-转氨酶作为生物催化剂是一种具有应用价值的方法。ArATA是来源于Arthrobactersp.KNK168的R-选择性ω-转氨酶，对(R)-1-(1-萘基)乙胺有催化活力[32]，能够催化外消旋1-(1-萘基)乙胺生成1-萘乙酮和(S)-1-(1-萘基)乙胺，并且转化率能达到50%，ee>99%。根据转氨酶催化反应的逆反应，ArATA能够催化1-萘乙酮生成(R)-1-(1-萘基)乙胺。由于基因挖掘时一般选择相对于模板同源性在30~80%的酶序列，将ArATA在NCBI数据库中进行比对，发现在同源性30~80%的转氨酶序列中，有3个酶的基因来源可在本实验室保藏的野生菌中找到，分别是地衣形芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）、抑制暗棕色杆菌（Phaeobacterinhibens）和高卢根瘤菌（Rhizobiumgallicum）。因此，拟将这四种转氨酶构建出来，用于筛选能够催化1-萘乙酮的转氨酶。首先对Bacilluslicheniformis、Phaeobacterinhibens和Rhizobiumgallicum分别使用营养肉汁培养基、柠檬酸铁铵培养基、根瘤菌培养基进行活化，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组，并进行凝胶核酸电泳检测，电泳分析结果如下图3-1所示：图3-1基因组DNA电泳图Figure3-1AgarosegelelectrophoresisofgenomicDNA注：M：Marker；1：Rhizobiumgallicum；2：Phaeobacterinhibens；3：Bacilluslicheniformis以基因组DNA为模板，使用附录1中P1和P2为引物对目的基因片段进行PCR扩增并进行纯化回收，目的基因片段大小约为1000bp，如图3-2所示：

【参考文献】：
期刊论文
[1]蛋白质工程：从定向进化到计算设计[J]. 曲戈,朱彤,蒋迎迎,吴边,孙周通.  生物工程学报. 2019(10)
[2]ω-转氨酶分子改造研究进展[J]. 高新星,韦平和.  生物工程学报. 2018(07)
[3]手性1-（1-萘基）乙胺的制备及其药物应用最新进展[J]. 卢定强,夏芙洁,王琦,孙生柏,凌岫泉.  现代化工. 2014(05)
[4]胺基裂解酶及其在医药中间体生产中的应用[J]. 何碧波,陈小龙,郑裕国,沈寅初.  微生物学通报. 2008(07)

硕士论文
[1]细菌耐丁醇元件的挖掘及大肠杆菌的溶剂耐受性研究[D]. 肖琳.江南大学 2019
[2]氨基酸脱氢酶的基因挖掘、定向改造及合成手性氨基酸的研究[D]. 程军.江南大学 2017



本文编号：3102243