巨噬细胞吞噬酿酒酵母孢子的机制研究

发布时间：2021-04-24 17:46

　　酿酒酵母一直被用来制造对人类有益的代谢产物,并且近年来发现酵母来源的葡聚糖具有提高动物免疫力的作用。酿酒酵母有两种形态:营养形态和子囊包裹的孢子形态。酵母子囊孢子壁的结构与营养态细胞不同,其最外层是二酪氨酸层,次外层是壳聚糖,内层是葡聚糖层,最内层是甘露糖层;而酵母营养态细胞壁最外层是甘露糖蛋白,内层是葡聚糖,最内层是几丁质层。酿酒酵母来源的葡聚糖（Zymosan）是一种碱不溶性的β-1,3键和β-1,6键连接的葡聚糖高聚物,能够被巨噬细胞识别和吞噬,并且能够增强动物免疫力,刺激细胞因子产生,抗病毒抗肿瘤抗感染等作用,还具有抑菌的作用。酵母chs3Δ突变体的孢子壁的壳聚糖层合成缺陷从而暴露葡聚糖层,设计利用chs3Δ作为葡聚糖微球检测其免疫性;酵母dit1Δ突变体孢子壁的二酪氨酸层合成缺陷从而暴露壳聚糖层,壳聚糖是由氨基多糖组成的,其具有免疫佐剂的作用,具有良好的生物相容性,具有抗菌消炎的作用,同时也能刺激增强免疫反应。因此本研究利用chs3Δ突变体孢子作为葡聚糖球,dit1Δ突变体作为壳聚糖球,并且检测其与酵母野生型孢子,营养态酵母对巨噬细胞刺激作用,我们发现野生型孢子,dit1Δ,... 

【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：97 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 概述
    1.2 酿酒酵母营养细胞以及子囊孢子壁结构概述
        1.2.1 酿酒酵母营养细胞壁成分
        1.2.2 酿酒酵母孢子壁结构以及成分
    1.3 巨噬细胞受体以及信号通路概述
        1.3.1 巨噬细胞补体受体以及免疫球蛋白受体
        1.3.2 巨噬细胞表面模式识别受体
        1.3.3 其他受体
    1.4 本论文的主要研究内容
        1.4.1 立题依据和研究意义
        1.4.2 本论文主要研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 细胞以及培养条件
        2.1.3 引物
        2.1.4 质粒
        2.1.5 培养基和试剂配制
        2.1.6 实验溶液及试剂和仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 绿色荧光酵母孢子的构建
        2.2.2 动物细胞质粒构建
        2.2.3 酵母培养和酵母孢子纯化
        2.2.4 细胞培养及质粒转化
            2.2.4.1 RAW264.7 细胞培养以及HEK293T细胞培养
            2.2.4.2 CHO-K1 细胞培养
            2.2.4.3 细胞因子的检测
            2.2.4.4 巨噬细胞与酵母或孢子共培养
            2.2.4.5 血清对巨噬细胞吞噬的影响
            2.2.4.6 巨噬细胞对 Zymosan 的吞噬
            2.2.4.7 巨噬细胞对 Latex beads 的吞噬
            2.2.4.8 抑制 Syk，PI3K 信号通路对巨噬细胞吞噬的影响
            2.2.4.9 F-actin 染色实验
            2.2.4.10 细胞转化质粒方法
            2.2.4.11 早期内吞体和晚期内吞体定位
            2.2.4.12 巨噬细胞吞噬酿酒酵母的溶酶体定位实验
        2.2.5 酿酒酵母野生型孢子配体探究实验
        2.2.6 纯化酿酒酵母孢子吞噬体
        2.2.7 构建受体基因敲除型巨噬细胞及吞噬效率检测
        2.2.8 逆转录病毒构建基因表达的细胞系及吞噬效率分析
        2.2.9 CHO-K1 细胞表达MAC-1 受体吞噬效率分析
        2.2.10 抑制型受体SIRPa和 FcγIIB对巨噬细胞吞噬酵母孢子影响
        2.2.11 小GTPase对巨噬细胞吞噬酵母孢子影响
        2.2.12 数据统计与分析
第三章 结果与讨论
    3.1 巨噬细胞对酿酒酵母孢子高效吞噬依赖于二酪氨酸的存在
        3.1.1 绿色荧光酿酒酵母构建以及孢子的纯化
        3.1.2 巨噬细胞对野生型酵母孢子的吞噬依赖于其孢子壁二酪氨酸层的存在
        3.1.3 酿酒酵母孢子的吞噬依赖于Syk以及PI3K
        3.1.4 酿酒酵母孢子吞噬后与内吞体融合进入溶酶体
        3.1.5 二酪氨酸层对于酿酒酵母孢子高效吞噬是必需的分子结构
        3.1.6 酿酒酵母野生型孢子与营养态酵母导致吞噬的配体不同
        3.1.7 巨噬细胞识别野生型酵母孢子依赖于二酪氨酸
    3.2 巨噬细胞识别酵母孢子的受体探究
        3.2.1 酵母孢子吞噬体的纯化
        3.2.2 酿酒酵母营养态和孢子吞噬体蛋白组质谱分析
        3.2.3 构建受体敲除的细胞系并分析其对孢子吞噬影响
        3.2.4 CD14介导部分孢子的吞噬并依赖于RNA配体的存在
        3.2.5 G-coupled受体对巨噬细胞吞噬的影响
        3.2.6 Fc受体通用γ链不参与酵母孢子吞噬过程
        3.2.7 MAC-1参与介导酿酒酵母孢子的吞噬
    3.3 抑制型受体和小GTP酶对巨噬细胞吞噬的作用
        3.3.1 Sirpa对巨噬细胞吞噬酵母以及孢子的影响
        3.3.2 FcγIIB对巨噬细胞吞噬酵母和孢子的影响
        3.3.3 Rho GTPase对巨噬细胞吞噬的影响
        3.3.4 RAP1A以及RRAS2 参与巨噬细胞吞噬酵母孢子过程
    3.4 本研究小结
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
附录
参考文献



本文编号：3157791