辅酶再生强化的多拷贝整合表达木糖还原酶大肠杆菌的构建

发布时间：2021-04-26 22:28

　　半纤维素资源是自然界中最丰富的可再生资源之一,将其通过微生物转化方法生产木糖醇是高值化利用的有效途径。本论文在实验室已有工作的基础上,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,对E.coli W3110进行代谢工程改造,强化其辅酶NADPH的再生,构建一株多拷贝整合木糖还原酶高产木糖醇的菌株。本工作采用双质粒CRISPR系统,通过构建不同pTargetF质粒和修复模板,使用木糖还原酶基因表达模块替换ptsG、ptsF和xylAB基因,获得一株整合了 3个木糖还原酶基因拷贝数的出发菌株WZ04。并在此基础上,分析大肠杆菌的葡萄糖代谢通路,通过实验分别敲除EMP途径中编码磷酸果糖激酶的pfkA、pfkB基因及磷酸葡萄糖异构酶的pgi基因和转氢酶sthA基因,获得相应的工程菌并检测胞内NADPH/NADP+的比值和发酵液中的木糖醇含量,获得了最优改造后的菌株WZ41。该菌株胞内辅酶NADPH/NADP+比值为出发菌株的1.68倍,有效地提高了木糖醇对葡萄糖的得率;通过RT-qPCR、菌株的生长性能及摇瓶发酵生产木糖醇的能力综合分析得出木糖还原酶表达模块的整合拷贝数最佳为5,使用该菌株进行摇瓶... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：93 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
中英文缩写对照表
第一章 文献综述
    1.1 木糖及木糖醇概述
    1.2 木糖醇的功能及市场
    1.3 木糖醇的产能及生产方式
        1.3.1 木糖醇的化学合成
        1.3.2 木糖醇的生物转化
    1.4 生产木糖醇微生物的分子生物学改造策略
        1.4.1 CCR效应的消除
        1.4.2 木糖代谢途径的改造
        1.4.3 木糖还原酶的改造
        1.4.4 木糖醇的转运系统改造
        1.4.5 副产物阿拉伯糖醇的消除
    1.5 重组大肠杆菌发酵生产木糖醇的研究进展
        1.5.1 木糖还原酶基因在大肠杆菌中的异源表达
        1.5.2 内源性辅酶NAD（P）H对木糖醇生产效率的影响
    1.6 基因组编辑技术的发展和应用
        1.6.1 传统基因组编辑技术的发展现状
        1.6.2 CRISPR/Cas9编辑技术的发展
    1.7 本课题的研究内容和意义
第二章 基于CRISPR/Cas9技术的整合型表达菌株的构建
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 菌株和质粒
        2.2.2 仪器和设备
        2.2.3 常用试剂、试剂盒和培养基配方
    2.3 实验方法
        2.3.1 CRISPR-Cas9质粒的构建
        2.3.2 基因组基因替换方法操作
        2.3.3 基因替换验证
        2.3.4 SDS-PAGE蛋白胶
        2.3.5 种子液制备
        2.3.6 摇瓶发酵
        2.3.7 糖和糖醇的液相检测方法
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 CRISPR-Cas9构建整合型表达菌株
        2.4.2 重组菌摇瓶发酵生产木糖醇
    2.5 小结
第三章 葡萄糖代谢途径改造强化胞内辅酶NADPH再生
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 菌株和质粒
        3.2.2 仪器和试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 大肠杆菌葡萄糖代谢通路分析
        3.3.2 不同位点整合对木糖还原酶的表达影响
        3.3.3 内源性辅酶的定量测定[87]
        3.3.4 大肠杆菌溶源化改造
        3.3.5 摇瓶发酵实验
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 EMP途径基因敲除对胞内辅酶含量的影响
        3.4.2 不同位点整合木糖还原酶基因对其转录水平的影响
        3.4.3 单个基因替换对内源性辅酶生成量和木糖醇产量的影响
        3.4.4 组合敲除不同基因对内源性辅酶和木糖醇产量的影响
    3.5 小结
第四章 木糖还原酶整合模块拷贝数的优化
    4.1 引言
    4.2 实验材料
    4.3 实验方法
        4.3.1 基因多拷贝整合
        4.3.2 大肠杆菌RNA的提取
        4.3.3 RT-qPCR对探究最佳拷贝数数量
        4.3.4 摇瓶发酵对木糖醇生产能力的验证
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 mRNA水平与木糖还原酶拷贝数的关系
        4.4.2 不同拷贝数的菌株木糖醇的生产能力
    4.5 小结
第五章 利用半纤维素水解液发酵生产木糖醇
    5.1 引言
    5.2 实验材料
    5.3 实验方法
        5.3.1 发酵原料的处理
        5.3.2 一级种子液培养
        5.3.3 二级种子液培养
        5.3.4 发酵过程控制
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 摇瓶发酵结果
        5.4.2 利用半纤维素水解液和木糖母液发酵生产木糖醇
    5.5 小结
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
        6.2.1 进一步增加木糖醇对葡萄糖的得率
        6.2.2 阿拉伯糖代谢通路增强
        6.2.3 木糖残糖的消除
        6.2.4 生物质资源的综合利用
参考文献
个人简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]crp基因突变对大肠杆菌利用混合碳源的影响[J]. 熊得王,刘晴,姚瑞莲,刘沅枫,张雪洪.  高校化学工程学报. 2015(06)
[2]CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在动物基因组定点修饰中的应用[J]. 周金伟,徐绮嫔,姚婧,余树民,曹随忠.  遗传. 2015(10)



本文编号：3162234