密码子优化的蛋清溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达和改性研究
发布时间：2021-06-10 13:37
溶菌酶（lysozyme,LYZ）是一种广泛存在于微生物、动植物和人体中的天然抗菌物质,可以非特异性地溶解致病菌细胞壁中的黏多糖。溶菌酶在一定程度上可以代替抗生素,减少细菌耐药性带来的危害,具有良好的应用前景,如饲料、化妆品、药品领域。它主要是通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细菌细胞壁裂解死亡,因此也叫做N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。溶菌酶主要作用对象是肽聚糖层较厚的革兰氏阳性菌,对革兰氏阴性菌的抗菌效果较差。目前市售溶菌酶主要利用化学分离方法从蛋清中获取,来源有限,化学提取的纯度较低、损失大,同时溶菌酶作为一种非广谱抗菌剂,应用存在局限性。目的:本实验选用较为成熟的毕赤酵母表达系统,通过发酵表达来获取更高产量高活力的蛋清溶菌酶,满足现行市场的工业需求。此外,扩宽蛋清溶菌酶的抗菌谱,更有利于产品的市场推广和应用,同时也为蛋白质的分子改造和性能优化提供理论参考。方法:采取密码子优化的策略,获得高效表达蛋清溶菌酶的酵母菌株。首先依据酵母菌属的密码子偏好性,对蛋清溶菌酶的ORF序列（Gene ID:396218）进行了部分碱基替换,使其更适于酵母表达体...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
蛋清溶菌酶序列与优化后基因比对Fig.1Alignmentofeggwhitelysozymesequenceandoptimizedgene
浙江大学硕士论文结果与讨论203.1.2表达载体pPIC9K-coEWL的构建和转化公司合成的优化蛋清溶菌酶全基因序列为DNA干粉，加水溶解后可直接作为模板使用。以coEWL-F、coEWL-R为引物，PCR大量扩增出带同源臂的coEWL基因的ORF区段，最终获得422bp目的基因产物。其核酸胶结果如图2所示。扩增产物coEWL纯化后连接至经双酶切的pPIC9K线性空载体，重组质粒转至大肠杆菌BL21(DE3)后，抗性平板筛选出阳性转化子，菌落生长情况如图3。随机选取一颗阳性单克隆抽提质粒，经BamHI、SalI双酶切后，预计会得到2614bp和7037bp大小的片段，结果如图4所示。测序结果显示重组质粒pPIC9K-coEWL构建正确。M:DL5000标志物1:双酶切条带图4重组表达载体pPIC9K-coEWL的双酶切验证Fig.4IdentificationofpPIC9K-coEWLbydoubledigestionM:DL2000标志物1:coEWL扩增产物图2coEWLPCR扩增产物Fig.2PCRproductofcoEWL图3大肠杆菌BL21(DE3)转化子Fig.3transformationofBL21(DE3)
浙江大学硕士论文结果与讨论203.1.2表达载体pPIC9K-coEWL的构建和转化公司合成的优化蛋清溶菌酶全基因序列为DNA干粉，加水溶解后可直接作为模板使用。以coEWL-F、coEWL-R为引物，PCR大量扩增出带同源臂的coEWL基因的ORF区段，最终获得422bp目的基因产物。其核酸胶结果如图2所示。扩增产物coEWL纯化后连接至经双酶切的pPIC9K线性空载体，重组质粒转至大肠杆菌BL21(DE3)后，抗性平板筛选出阳性转化子，菌落生长情况如图3。随机选取一颗阳性单克隆抽提质粒，经BamHI、SalI双酶切后，预计会得到2614bp和7037bp大小的片段，结果如图4所示。测序结果显示重组质粒pPIC9K-coEWL构建正确。M:DL5000标志物1:双酶切条带图4重组表达载体pPIC9K-coEWL的双酶切验证Fig.4IdentificationofpPIC9K-coEWLbydoubledigestionM:DL2000标志物1:coEWL扩增产物图2coEWLPCR扩增产物Fig.2PCRproductofcoEWL图3大肠杆菌BL21(DE3)转化子Fig.3transformationofBL21(DE3)
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2[J]. 黄鹏,阎丽萍,张宁,石金磊. 中国生物工程杂志. 2018(10)
[2]榛仁降脂活性肽分离纯化及结构鉴定[J]. 周美含,郭勇,魏贞,赵兰,秦汉雄,王辑,闵伟红. 食品科学. 2019(16)
[3]蛋清溶菌酶改性研究进展[J]. 刘纪红,马美湖. 中国家禽. 2018(15)
[4]基于外泌蛋白质组的酿酒酵母信号肽元件的分析及鉴定[J]. 田雷瑜,曹筠嵩,刘忞之,杨燕,王伟. 中国医药生物技术. 2018(04)
[5]整体优化的信号肽和人溶菌酶基因在毕赤酵母的高效表达[J]. 陈珊珊,丁健,李鑫,刘军,贾禄强,槐强强,孙佼文,史仲平. 江苏农业学报. 2018(01)
[6]一种猪溶菌酶来源的抗菌六肽的分离鉴定及其性质[J]. 朱德伟,蔡国林,陆健. 生物工程学报. 2017(06)
[7]重组毕赤酵母表达蛋清溶菌酶发酵条件的优化[J]. 孙玮遥,宋增健,王向东,林剑. 中国酿造. 2017 (02)
[8]溶菌酶在防治仔猪大肠杆菌病中的应用分析[J]. 张跃海,张明琼. 当代畜牧. 2016(29)
[9]海参i-型溶菌酶在毕赤酵母基因工程菌中优化表达及纯化[J]. 马俊,张洋,丛丽娜,李成. 工业微生物. 2016(02)
[10]天然微生物防腐剂溶菌酶在食品中的应用研究[J]. 崔红. 中国食物与营养. 2015(12)
博士论文
[1]猪溶菌酶的重组表达及其增效研究[D]. 朱德伟.江南大学 2017
硕士论文
[1]鸡蛋清中溶菌酶的提取及改性研究[D]. 杨曼利.江南大学 2014
[2]毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶研究[D]. 左小虎.安徽大学 2012
本文编号：3222475
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
蛋清溶菌酶序列与优化后基因比对Fig.1Alignmentofeggwhitelysozymesequenceandoptimizedgene
浙江大学硕士论文结果与讨论203.1.2表达载体pPIC9K-coEWL的构建和转化公司合成的优化蛋清溶菌酶全基因序列为DNA干粉，加水溶解后可直接作为模板使用。以coEWL-F、coEWL-R为引物，PCR大量扩增出带同源臂的coEWL基因的ORF区段，最终获得422bp目的基因产物。其核酸胶结果如图2所示。扩增产物coEWL纯化后连接至经双酶切的pPIC9K线性空载体，重组质粒转至大肠杆菌BL21(DE3)后，抗性平板筛选出阳性转化子，菌落生长情况如图3。随机选取一颗阳性单克隆抽提质粒，经BamHI、SalI双酶切后，预计会得到2614bp和7037bp大小的片段，结果如图4所示。测序结果显示重组质粒pPIC9K-coEWL构建正确。M:DL5000标志物1:双酶切条带图4重组表达载体pPIC9K-coEWL的双酶切验证Fig.4IdentificationofpPIC9K-coEWLbydoubledigestionM:DL2000标志物1:coEWL扩增产物图2coEWLPCR扩增产物Fig.2PCRproductofcoEWL图3大肠杆菌BL21(DE3)转化子Fig.3transformationofBL21(DE3)
浙江大学硕士论文结果与讨论203.1.2表达载体pPIC9K-coEWL的构建和转化公司合成的优化蛋清溶菌酶全基因序列为DNA干粉，加水溶解后可直接作为模板使用。以coEWL-F、coEWL-R为引物，PCR大量扩增出带同源臂的coEWL基因的ORF区段，最终获得422bp目的基因产物。其核酸胶结果如图2所示。扩增产物coEWL纯化后连接至经双酶切的pPIC9K线性空载体，重组质粒转至大肠杆菌BL21(DE3)后，抗性平板筛选出阳性转化子，菌落生长情况如图3。随机选取一颗阳性单克隆抽提质粒，经BamHI、SalI双酶切后，预计会得到2614bp和7037bp大小的片段，结果如图4所示。测序结果显示重组质粒pPIC9K-coEWL构建正确。M:DL5000标志物1:双酶切条带图4重组表达载体pPIC9K-coEWL的双酶切验证Fig.4IdentificationofpPIC9K-coEWLbydoubledigestionM:DL2000标志物1:coEWL扩增产物图2coEWLPCR扩增产物Fig.2PCRproductofcoEWL图3大肠杆菌BL21(DE3)转化子Fig.3transformationofBL21(DE3)
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2[J]. 黄鹏,阎丽萍,张宁,石金磊. 中国生物工程杂志. 2018(10)
[2]榛仁降脂活性肽分离纯化及结构鉴定[J]. 周美含,郭勇,魏贞,赵兰,秦汉雄,王辑,闵伟红. 食品科学. 2019(16)
[3]蛋清溶菌酶改性研究进展[J]. 刘纪红,马美湖. 中国家禽. 2018(15)
[4]基于外泌蛋白质组的酿酒酵母信号肽元件的分析及鉴定[J]. 田雷瑜,曹筠嵩,刘忞之,杨燕,王伟. 中国医药生物技术. 2018(04)
[5]整体优化的信号肽和人溶菌酶基因在毕赤酵母的高效表达[J]. 陈珊珊,丁健,李鑫,刘军,贾禄强,槐强强,孙佼文,史仲平. 江苏农业学报. 2018(01)
[6]一种猪溶菌酶来源的抗菌六肽的分离鉴定及其性质[J]. 朱德伟,蔡国林,陆健. 生物工程学报. 2017(06)
[7]重组毕赤酵母表达蛋清溶菌酶发酵条件的优化[J]. 孙玮遥,宋增健,王向东,林剑. 中国酿造. 2017 (02)
[8]溶菌酶在防治仔猪大肠杆菌病中的应用分析[J]. 张跃海,张明琼. 当代畜牧. 2016(29)
[9]海参i-型溶菌酶在毕赤酵母基因工程菌中优化表达及纯化[J]. 马俊,张洋,丛丽娜,李成. 工业微生物. 2016(02)
[10]天然微生物防腐剂溶菌酶在食品中的应用研究[J]. 崔红. 中国食物与营养. 2015(12)
博士论文
[1]猪溶菌酶的重组表达及其增效研究[D]. 朱德伟.江南大学 2017
硕士论文
[1]鸡蛋清中溶菌酶的提取及改性研究[D]. 杨曼利.江南大学 2014
[2]毕赤酵母表达甘露糖化人溶菌酶研究[D]. 左小虎.安徽大学 2012
本文编号：3222475
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