枯草杆菌蛋白酶工程改造及发酵条件筛选
发布时间：2021-06-19 18:13
枯草杆菌蛋白酶属于细胞外丝氨酸内肽酶。枯草杆菌蛋白酶存在于古细菌、真细菌、真核生物和病毒中,主要特征是存在保守的Asp,His和Ser催化三联体。枯草杆菌蛋白酶属于丝氨酸肽酶或蛋白酶第二大家族（S8家族）的S8A亚家族成员。枯草杆菌蛋白酶具有广泛的底物特异性,在中性和碱性pH下具有较高活性和稳定性,常被用作洗涤、制革、食品等行业的生物添加剂。枯草杆菌蛋白酶在过去几十年一直是酶制剂研究开发的热点。本论文首先化学合成嗜碱性芽孢杆菌PB92的碱性蛋白酶基因Bapb92克隆至pBE2R载体中并转化到Bacillus subtilis WB600中构建重组工程菌Bacillus subtilis WB600/pBE2R-Bapb92。重组枯草杆菌工程菌利用糊精1%,可溶性淀粉2%,酵母提取物1%,NaCl 0.5%,pH7.0培养基进行发酵表达,培养60小时后进行菌液分离。发酵上清液经70%硫酸铵沉淀、SephadexG-25脱盐和Sephadex75层析三个步骤,获得电泳纯的碱性蛋白酶,纯化倍数6.8倍,比活2200U/mg,产率39%,经12%SDS-PAGE和质谱检测目的蛋白分子量为26....
【文章来源】：山西大学山西省
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
MEROPS数据库中丝氨酸蛋白酶家族中胰蛋白酶家族和枯草杆菌蛋白酶家族中典型的蛋白酶成熟肽结构对比
第一章综述7图1.2生物催化工艺开发策略[31-33]Figure1.2Biocatalyticprocessdevelopmentstrategies.1.4.1菌种的筛选和改良在用于工业领域中的微生物中，芽孢杆菌属是生产碱性蛋白酶的主要来源。芽孢杆菌属是细菌中最古老和最多样化的属类[34]，属于兼性厌氧或需氧的革兰氏阳性菌，杆状，有内生孢子形成，基因组大小介于3.35Mb和5.5Mb之间，GC含量35%-46%，其特征具有多样性[35]。芽孢杆菌属的一个重要的工业应用是酶的生产，包括脂肪酶、碳水化合物活性酶、蛋白酶等，其中蛋白水解酶占有重要的作用[36]。芽孢杆菌具有生长迅速、发酵周期短、分泌大量蛋白至胞外培养基的优点，在工业上是一种重要的生产菌种，大多数芽孢杆菌向培养基中分泌的丝氨酸蛋白酶，被广泛应用于食品、饮料、皮革、制药、医疗和洗涤工业领域[37]。美国食品和药品管理局已将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌授予GRAS（公认安全）状态。尽管基因工程和蛋白质工程改变了蛋白质的性质，但仍不可能获得完全理想的微生物蛋白酶。生物多样性是生物技术创新的宝贵资源，对于寻找工业中使用的理想菌种起着关键作用。南北极、盐碱地或者火山深海这些极端环境中分离的微生物产生的酶可能具有一些天然适合工业使用的性质。每年大约有十种新的野生型subtilisin出现在专利或文献中[29,38,39]，除了经典的微生物筛选方法外，还通过全基因组筛选新特征的酶[37]。但菌种改良自始至终在微生物发酵工艺的商业开发中发挥着关键作用。通常，野生菌的产酶量是有限的，然而在很多情况下，选择一些简单的方法例如在特定的培养基上培养，有可能挑选出产量大幅度
第二章枯草杆菌蛋白酶BAPB92重组表达及纯化27pBE2R-F2pBE2R-R2模板2ddH2O1.9dNTP1EasyTaqDNAPolymerase0.1图2.1pBE2R-Bapb92表达载体构建过程质粒图谱Figure2.1PlasmidmapofconstructionofexpressionvectorpBE2R-Bapb922.3.2BAPB92的表达（1）重组质粒pBE2R-Bapb92的转化BacillussubtilisWB600感受态的制备是使用Spizizen创立的方法经过一定改进得来的[7,11-15]：首先将活化后的单菌落接种于GMⅠ中，37℃，200rpm培养至OD=0.6~0.8；在GMII溶液中接种10%的GMⅠ菌液，37℃培养至OD=0.3~0.4；将菌液冰浴30min后低速离心（5000rpm）弃上清，加入10mLGMⅢ分装后保存在-80℃冰箱中。将测序正确的质粒5μL转入BacillussubtilisWB600感受态细胞中，37℃，200rpm培养90min后涂布在含有卡那霉素抗性（40μg/mL）的牛奶平板（蛋白胨1%，NaCl1%，酵母提取物0.5%，牛奶2%，琼脂粉1.5%，pH7.0[7,11]）上，于37℃培养24h，获得重组BacillussubtilisWB600/pBE2R-Bapb92，根据透明圈初步判断是否产生蛋白酶[7,16]。（2）BacillussubtilisWB600/pBE2R-Bapb92蛋白酶的发酵
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶发酵条件优化[J]. 周桂旭,文阳宣,李新锋,石亚伟. 山西大学学报(自然科学版). 2020(02)
[2]发酵大豆中产碱性蛋白酶菌株鉴定及其部分酶学性质研究[J]. 魏婷婷,周桂旭,石亚伟. 山西大学学报(自然科学版). 2019(01)
[3]响应面法优化短小芽孢杆菌SCU11发酵产碱性蛋白酶及关键基因转录调控分析[J]. 尹萌萌,贺婷停,王超,宋婷,王海燕. 应用与环境生物学报. 2016(03)
[4]微生物利用油茶籽油工艺水产碱性蛋白酶初探[J]. 苏悟,郑小芬,徐睿烜,蒋立文,郭华,周建平. 中国粮油学报. 2016(03)
[5]纳豆芽孢杆菌FK-3液体发酵条件优化[J]. 赵彩春,区毅垣,史宝军. 饲料工业. 2016(03)
[6]枯草芽孢杆菌突变株IA857高效转化方法的研究[J]. 牛福星,于晶晶,汤宏赤,刘金平,滕昆,韦宇拓. 广西科学. 2014(02)
[7]产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其发酵条件优化[J]. 宋明徽,丛丽娜,王红英,姜启晨. 大连工业大学学报. 2013(06)
[8]木瓜蛋白酶的活力检测标准研究[J]. 张兴灿,陈朝银,李汝荣. 食品工业科技. 2011(10)
[9]大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的构建及碱性蛋白酶的表达[J]. 梁晓梅,黎明,成堃,贾红红,路福平. 生物技术通报. 2011(06)
[10]枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究[J]. 李瑞芳,薛雯雯,黄亮,熊前程,王彬. 生物技术通报. 2011(05)
硕士论文
[1]产碱性蛋白酶菌株BN-2的鉴定及其重组酶的酶学性质表征[D]. 魏婷婷.山西大学 2019
[2]毕赤酵母和枯草杆菌产碱性蛋白酶的对比研究[D]. 王境.山西大学 2019
[3]提取分离枯草芽孢杆菌中性蛋白酶生产工艺的研究[D]. 赵素珍.齐鲁工业大学 2017
[4]大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pBE2R的构建及应用[D]. 梁晓梅.天津科技大学 2011
本文编号：3238299
【文章来源】：山西大学山西省
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
MEROPS数据库中丝氨酸蛋白酶家族中胰蛋白酶家族和枯草杆菌蛋白酶家族中典型的蛋白酶成熟肽结构对比
第一章综述7图1.2生物催化工艺开发策略[31-33]Figure1.2Biocatalyticprocessdevelopmentstrategies.1.4.1菌种的筛选和改良在用于工业领域中的微生物中，芽孢杆菌属是生产碱性蛋白酶的主要来源。芽孢杆菌属是细菌中最古老和最多样化的属类[34]，属于兼性厌氧或需氧的革兰氏阳性菌，杆状，有内生孢子形成，基因组大小介于3.35Mb和5.5Mb之间，GC含量35%-46%，其特征具有多样性[35]。芽孢杆菌属的一个重要的工业应用是酶的生产，包括脂肪酶、碳水化合物活性酶、蛋白酶等，其中蛋白水解酶占有重要的作用[36]。芽孢杆菌具有生长迅速、发酵周期短、分泌大量蛋白至胞外培养基的优点，在工业上是一种重要的生产菌种，大多数芽孢杆菌向培养基中分泌的丝氨酸蛋白酶，被广泛应用于食品、饮料、皮革、制药、医疗和洗涤工业领域[37]。美国食品和药品管理局已将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌授予GRAS（公认安全）状态。尽管基因工程和蛋白质工程改变了蛋白质的性质，但仍不可能获得完全理想的微生物蛋白酶。生物多样性是生物技术创新的宝贵资源，对于寻找工业中使用的理想菌种起着关键作用。南北极、盐碱地或者火山深海这些极端环境中分离的微生物产生的酶可能具有一些天然适合工业使用的性质。每年大约有十种新的野生型subtilisin出现在专利或文献中[29,38,39]，除了经典的微生物筛选方法外，还通过全基因组筛选新特征的酶[37]。但菌种改良自始至终在微生物发酵工艺的商业开发中发挥着关键作用。通常，野生菌的产酶量是有限的，然而在很多情况下，选择一些简单的方法例如在特定的培养基上培养，有可能挑选出产量大幅度
第二章枯草杆菌蛋白酶BAPB92重组表达及纯化27pBE2R-F2pBE2R-R2模板2ddH2O1.9dNTP1EasyTaqDNAPolymerase0.1图2.1pBE2R-Bapb92表达载体构建过程质粒图谱Figure2.1PlasmidmapofconstructionofexpressionvectorpBE2R-Bapb922.3.2BAPB92的表达（1）重组质粒pBE2R-Bapb92的转化BacillussubtilisWB600感受态的制备是使用Spizizen创立的方法经过一定改进得来的[7,11-15]：首先将活化后的单菌落接种于GMⅠ中，37℃，200rpm培养至OD=0.6~0.8；在GMII溶液中接种10%的GMⅠ菌液，37℃培养至OD=0.3~0.4；将菌液冰浴30min后低速离心（5000rpm）弃上清，加入10mLGMⅢ分装后保存在-80℃冰箱中。将测序正确的质粒5μL转入BacillussubtilisWB600感受态细胞中，37℃，200rpm培养90min后涂布在含有卡那霉素抗性（40μg/mL）的牛奶平板（蛋白胨1%，NaCl1%，酵母提取物0.5%，牛奶2%，琼脂粉1.5%，pH7.0[7,11]）上，于37℃培养24h，获得重组BacillussubtilisWB600/pBE2R-Bapb92，根据透明圈初步判断是否产生蛋白酶[7,16]。（2）BacillussubtilisWB600/pBE2R-Bapb92蛋白酶的发酵
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶发酵条件优化[J]. 周桂旭,文阳宣,李新锋,石亚伟. 山西大学学报(自然科学版). 2020(02)
[2]发酵大豆中产碱性蛋白酶菌株鉴定及其部分酶学性质研究[J]. 魏婷婷,周桂旭,石亚伟. 山西大学学报(自然科学版). 2019(01)
[3]响应面法优化短小芽孢杆菌SCU11发酵产碱性蛋白酶及关键基因转录调控分析[J]. 尹萌萌,贺婷停,王超,宋婷,王海燕. 应用与环境生物学报. 2016(03)
[4]微生物利用油茶籽油工艺水产碱性蛋白酶初探[J]. 苏悟,郑小芬,徐睿烜,蒋立文,郭华,周建平. 中国粮油学报. 2016(03)
[5]纳豆芽孢杆菌FK-3液体发酵条件优化[J]. 赵彩春,区毅垣,史宝军. 饲料工业. 2016(03)
[6]枯草芽孢杆菌突变株IA857高效转化方法的研究[J]. 牛福星,于晶晶,汤宏赤,刘金平,滕昆,韦宇拓. 广西科学. 2014(02)
[7]产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其发酵条件优化[J]. 宋明徽,丛丽娜,王红英,姜启晨. 大连工业大学学报. 2013(06)
[8]木瓜蛋白酶的活力检测标准研究[J]. 张兴灿,陈朝银,李汝荣. 食品工业科技. 2011(10)
[9]大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒的构建及碱性蛋白酶的表达[J]. 梁晓梅,黎明,成堃,贾红红,路福平. 生物技术通报. 2011(06)
[10]枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究[J]. 李瑞芳,薛雯雯,黄亮,熊前程,王彬. 生物技术通报. 2011(05)
硕士论文
[1]产碱性蛋白酶菌株BN-2的鉴定及其重组酶的酶学性质表征[D]. 魏婷婷.山西大学 2019
[2]毕赤酵母和枯草杆菌产碱性蛋白酶的对比研究[D]. 王境.山西大学 2019
[3]提取分离枯草芽孢杆菌中性蛋白酶生产工艺的研究[D]. 赵素珍.齐鲁工业大学 2017
[4]大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pBE2R的构建及应用[D]. 梁晓梅.天津科技大学 2011
本文编号：3238299
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3238299.html
最近更新
教材专著
