基于Spy化学的蛋白定向固定化
发布时间：2021-07-13 02:20
定向固定化的蛋白具有均一的取向,能最大限度地保持蛋白的活性,因此蛋白的定向固定化在工业生物催化、临床诊断和蛋白相互作用分析等领域有着广泛的应用。近年来逐渐开发一些新的定向固定化方法。生物正交反应（如点击化学）需要引入非天然氨基酸,内含肽切割引入巯基则需要额外分离步骤等、存在产量低等问题,通过酶催化修饰特定的基序/标签,则需要消耗过量酶,且效率低。因此,目前的定向固定化方法都不适合大规模应用。本文利用Spy Catcher-Spy Tag反应特异性地、高效地形成异肽键的原理,以开发一种适用于工业酶的定向固定化,特别是从发酵细胞裂解液中目标蛋白直接定向固定化的新方法。此方法首先将Spy Catcher共价地固定在载体上,然后将Spy Tag融合的目标蛋白通过与Spy Catcher的连接反应,实现目标蛋白的定向固定化。本文选择广泛使用的商业化环氧载体LX-1000EP,并以红色荧光蛋白（Red fluorescent protein,RFP）、戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶（Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase,GA）和甲酸脱氢酶（Fo...
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：106 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
蛋白的固定化方法[12]
第一章绪论3稳定性[23]，增强其在极端变形条件下的稳定性，以及提高酶的负荷[22]。这些性能的提高主要是由于位点特异性蛋白固定化排除了固定化中常出现的多点附着、多方位和空间位阻等问题。图1-2酶的定向固定化[24]Fig.1.2Biospecificorientedenzymeimmobilization目前的蛋白定向固定化主要通过亲和标签、化学修饰和生物修饰等几种方法实现：1.1.3.1通过亲和标签的定向固定化亲和标签是能够结合特定蛋白质或酶或特定载体的配体。常用的亲和标签及其定向固定化方法如下：1）Concanavalin（ConA），可用于结合糖基化酶。Wallace和Lovenberg可能是在20世纪70年代中期第一批制备这种固定化酶的科学家，他们使用Sepharose-boundConA（作为选择性配体）对多巴胺A-羟化酶进行亲和结合[25]。由于糖基化酶在ConA载体上的结合是非共价的，可以通过在高浓度的糖/糖苷或酸性pH条件下孵育来消除这种非共价结合，因此，这种固定化结合通常是不稳定的，会存在固定化酶泄露的问题[26]。2）亲和素-生物素相互作用。生物素具有一个融合环结构，其中包含一个脲基（四氢亚胺）环和一个由戊酸连接的四氢噻吩环；亲和素亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kDa[27]。一个亲和素亚基可以与一个生物素分子形成紧密的非共价键，如图1-3所示，这是一种是已知最强的蛋白质-配体相互作用，在强度上非常接近共价键[28]，它们除了特殊的配体结合特性外，还具有良好的耐热性、抗极端pH、变性和蛋白水解的稳定性。利用亲和素-生物素相互作用制备固定化蛋白有两种方法：（1）目的蛋白生物素化，
华南理工大学硕士学位论文4然后与带有亲和素的载体结合；（2）目的蛋白融合亲和标签，从而与带有生物素的载体结合。虽然亲和素/链霉亲和素-生物素介导的酶固定化比其他非共价固定化方法可以更紧密地将目标酶与载体结合，但是该方法与其他非共价固定化方法相比，固定化过程相对复杂，此外亲和素（68kDa）和链霉亲和素（60kDa）都是大蛋白（四聚体），在融合表达的时候可能会对目的蛋白产生不利影响。图1-3通过亲和素-生物素相互作用将蛋白固定在NP上[29]Fig.1.3Proteinimmobilizationtonanoparticles(NP)viatheinteractionbetweenbiotinandstreptavidin/avidin3）Poly（his）标签与Co2+/Ni2+之间的相互作用。Poly（his）标签（6×His-tag）与二价金属阳离子（Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe2+或Zn2+）之间的螯合作用，是另一种非共价酶固定化方法（如图1-4所示）。组氨酸残基的咪唑环能与金属离子配合形成稳定的偶联物[30,31]。为了实现目的蛋白的固定化，必须在蛋白的N/C-末端融合6×His-tag，在捕获二价金属离子之前，先用次氮基三乙（NTA）或亚氨基二乙酸将载体材料活化。使用这种特殊的非共价方法将酶固定在载体上有几个优点:（1）在固定化前不需要纯化目标酶，即含有his标签的蛋白的细胞裂解液可直接用于固定化；（2）酶在固定后通常能保持其固有的三维结构，因此具有较高的活性；（3）由于咪唑可以很容易地将固定化酶洗脱，因此改性后的载体可以被回收再利用。由于此方法的高特异性和亲和性，这种相互作用被广泛应用于蛋白质纯化，被称为固定化金属亲和层析。而通过His-tag仅固定了少数几种酶用于生物催化研究。例如，将辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP）固定在NTA-Co2+修饰的金纳米粒子上，通过6×His-tag取?
【参考文献】：
期刊论文
[1]环氧树脂固定化卤醇脱卤酶的研究[J]. 顾恺,邹树平,王志才,郑裕国. 现代化工. 2016(11)
[2]环氧树脂固定化拟南芥腈水解酶NIT的研究[J]. 嵇东情,郑仁朝,郑裕国. 精细与专用化学品. 2015(05)
本文编号：3281138
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：106 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
蛋白的固定化方法[12]
第一章绪论3稳定性[23]，增强其在极端变形条件下的稳定性，以及提高酶的负荷[22]。这些性能的提高主要是由于位点特异性蛋白固定化排除了固定化中常出现的多点附着、多方位和空间位阻等问题。图1-2酶的定向固定化[24]Fig.1.2Biospecificorientedenzymeimmobilization目前的蛋白定向固定化主要通过亲和标签、化学修饰和生物修饰等几种方法实现：1.1.3.1通过亲和标签的定向固定化亲和标签是能够结合特定蛋白质或酶或特定载体的配体。常用的亲和标签及其定向固定化方法如下：1）Concanavalin（ConA），可用于结合糖基化酶。Wallace和Lovenberg可能是在20世纪70年代中期第一批制备这种固定化酶的科学家，他们使用Sepharose-boundConA（作为选择性配体）对多巴胺A-羟化酶进行亲和结合[25]。由于糖基化酶在ConA载体上的结合是非共价的，可以通过在高浓度的糖/糖苷或酸性pH条件下孵育来消除这种非共价结合，因此，这种固定化结合通常是不稳定的，会存在固定化酶泄露的问题[26]。2）亲和素-生物素相互作用。生物素具有一个融合环结构，其中包含一个脲基（四氢亚胺）环和一个由戊酸连接的四氢噻吩环；亲和素亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kDa[27]。一个亲和素亚基可以与一个生物素分子形成紧密的非共价键，如图1-3所示，这是一种是已知最强的蛋白质-配体相互作用，在强度上非常接近共价键[28]，它们除了特殊的配体结合特性外，还具有良好的耐热性、抗极端pH、变性和蛋白水解的稳定性。利用亲和素-生物素相互作用制备固定化蛋白有两种方法：（1）目的蛋白生物素化，
华南理工大学硕士学位论文4然后与带有亲和素的载体结合；（2）目的蛋白融合亲和标签，从而与带有生物素的载体结合。虽然亲和素/链霉亲和素-生物素介导的酶固定化比其他非共价固定化方法可以更紧密地将目标酶与载体结合，但是该方法与其他非共价固定化方法相比，固定化过程相对复杂，此外亲和素（68kDa）和链霉亲和素（60kDa）都是大蛋白（四聚体），在融合表达的时候可能会对目的蛋白产生不利影响。图1-3通过亲和素-生物素相互作用将蛋白固定在NP上[29]Fig.1.3Proteinimmobilizationtonanoparticles(NP)viatheinteractionbetweenbiotinandstreptavidin/avidin3）Poly（his）标签与Co2+/Ni2+之间的相互作用。Poly（his）标签（6×His-tag）与二价金属阳离子（Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe2+或Zn2+）之间的螯合作用，是另一种非共价酶固定化方法（如图1-4所示）。组氨酸残基的咪唑环能与金属离子配合形成稳定的偶联物[30,31]。为了实现目的蛋白的固定化，必须在蛋白的N/C-末端融合6×His-tag，在捕获二价金属离子之前，先用次氮基三乙（NTA）或亚氨基二乙酸将载体材料活化。使用这种特殊的非共价方法将酶固定在载体上有几个优点:（1）在固定化前不需要纯化目标酶，即含有his标签的蛋白的细胞裂解液可直接用于固定化；（2）酶在固定后通常能保持其固有的三维结构，因此具有较高的活性；（3）由于咪唑可以很容易地将固定化酶洗脱，因此改性后的载体可以被回收再利用。由于此方法的高特异性和亲和性，这种相互作用被广泛应用于蛋白质纯化，被称为固定化金属亲和层析。而通过His-tag仅固定了少数几种酶用于生物催化研究。例如，将辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP）固定在NTA-Co2+修饰的金纳米粒子上，通过6×His-tag取?
【参考文献】：
期刊论文
[1]环氧树脂固定化卤醇脱卤酶的研究[J]. 顾恺,邹树平,王志才,郑裕国. 现代化工. 2016(11)
[2]环氧树脂固定化拟南芥腈水解酶NIT的研究[J]. 嵇东情,郑仁朝,郑裕国. 精细与专用化学品. 2015(05)
本文编号：3281138
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