维生素K2菌株的选育及高效发酵技术的研究

发布时间：2021-07-29 15:37

　　维生素K2（VK2）是一类重要的脂溶性维生素,具有预防和治疗骨质疏松、凝血、血管钙化、癌症肿瘤等多种重要的生理功能。VK2的市场需求与日俱增,使用纳豆菌发酵生产VK2是其主要生产方法,但由于菌种的产量较低,满足不了工业化生产的需求。本文采用紫外和NGT诱变相结合的方法选育VK2高产菌株,对其高效生产VK2的发酵工艺进行优化,并基于转录组学技术,对维生素K2的高产机理进行了研究。结果如下:（1）以实验室保藏的一株纳豆芽孢杆菌菌株（M）为出发菌株,通过紫外和NTG复合诱变筛选得到突变菌株H56,产量达到65.79 mg/L,比原始菌株M提高了24.60倍。（2）通过单因素实验对突变菌株H56发酵生产VK2的发酵条件,培养基组分等进行了筛选。结果表明,纳豆芽孢杆菌H56发酵生产VK2的适宜条件为:发酵时间96 h,接种量2%,初始发酵pH为7.2,装液量16 mL/50 mL,蔗糖10 g/L、大豆蛋白15 g/L、氯化钠2.5 g/L、硫酸镁4 g/L、磷酸氢二钾0.05 g/L、氯化钙0.2 g/L、硫酸锰0.6 g/L,筛选后VK2的最高产量达到122.03 mg/L,比原始菌株提高了... 

【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省

【文章页数】：88 页

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VK2的化学构造式

沈阳农业大学硕士论文7磷酸合酶组分I）和hepS（庚二烯基二磷酸合酶成分II），其中hepT和hepS控制同一个酶的两个亚基的合成（LujingRenaetal，2020）。图1-2维生素K2的生物合成途径Fig1-2BiosyntheticpathwayofvitaminK21.3.2维生素K2的来源人体自身不能合成维生素K2，只能从食物或膳食补充剂中获得。然而，正常食物中维生素K2的含量却很低，6.25kg猪肉或7.14kg鸡蛋中只有1mg维生素K2（Walther&Chollet，2017）。因此维生素K2还被称为“铂维生素”。目前，维生素K2有三种来源：（1）来自植物、动物或食物；（2）化学合成；（3）微生物生产。在食物中纳豆是维生素K2的主要来源，每100g纳豆中含有800-900μg维生素K2（Tarvainenetal，2019）。此外，在奶酪（Vermeeretal，2018）、蜂蜜（Brudzynski&Maldonado，2018）、肉类、酸奶、牛奶（Walther&Chollet，2017）等其他食物中也发现了微量的维生素K2。传统的维生素K2合成都采用化学合成法，存在化学前体原料来源受限、副产物多、产率低、活性低、环境污染等问题。所以尽管维生素K2的化学合成已经工业化，但由于上述化学工艺的缺陷，仍需探索新的生产方法。因为维生素K2是呼吸链的重要电子传递载体，所以许多微生物都能产维生素K2（Bentleyetal，1971），并且合成的维生素K2具有活性高，副产物少，专一性高等优点。Tani等人发现细菌是维生素K2的主要生产者（Tanietal，1984），不同的菌株可以产出不同类型的维生素K2，枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilisnatto）主要产MK-4到MK-8（Berenjlanetal，2014），

沈阳农业大学硕士学位论文19分别用液相色谱和质谱对纳豆芽孢杆菌发酵液的有机溶剂（正己烷与异丙醇）提取物进行分析，结果如图2-1所示，在液相色谱图上，纳豆芽孢杆菌发酵产物在12.87min出现了一个强吸收峰，其保留时间与维生素K2标准品的保留时间（12.87min）一致。同时，如图2-2所示，此峰的质谱图上也显示出了维生素K2特征的分子离子峰（m/z=650，M+1）。因此可以推断纳豆芽孢杆菌发酵产物在液相色谱的12.87min处的洗脱峰所对应的产物为本研究的目的产物维生素K2。图2-1纳豆芽孢杆菌发酵产物的液相色谱图Figure2-1HPLCprofileoforganicextractsfromfermentationbrothofBafillusnattosolvent图2-2纳豆芽孢杆菌发酵产物的液相质谱图Figure2-2HPLCmassspectrumoforganicextractsfromfermentationbrothofBafillusnattosolvent2.3.2维生素K2的标准曲线按照2.2.1.3的方法，做出维生素K2的标准曲线如图2-3所示，维生素K2浓度与峰面积的线性关系式为y=5338x，其中y为峰面积，x为维生素K2（MK-7）浓度（mg/L）。AU0.000.020.040.060.080.10Minutes2.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.00VK2标准品发酵样品

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本文编号：3309592