解淀粉芽孢杆菌GGT在B.subtilis中的表达及其合成L-茶氨酸的研究
发布时间：2021-07-30 06:14
γ-谷氨酰基转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase,GGT）广泛存在于生物体中,GGT能够催化γ-谷氨酰基转移到氨基酸或肽上。微生物来源的GGT底物特异性更广,这意味在其催化下能够合成多种γ-谷氨酰基氨基酸衍生物或肽,这些酶促合成产物在医药食品领域具有重要应用价值。例如GGT能够以L-谷氨酰胺和乙胺为底物,催化合成L-茶氨酸。L-茶氨酸是茶叶中的一种主要氨基酸,它具有去苦提鲜改善食品风味的功能,在药品及保健品领域具有极高的开发价值。国内外对于L-茶氨酸的需求日益剧增,人们也更加关注高品质GGT的制备。本研究以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens BH072）GGT为研究对象,将其基因导入到枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中,成功实现重组GGT在B.subtilis 168中的高效分泌表达及纯化,并对重组酶的酶学性质进行研究分析,最后利用重组酶实现了L-茶氨酸的生产。主要实验结果如下:（1）提取B.amyloliquefaciens BH072基因组DNA,以其为模板,扩增ggt-6his/ggtΔsp
【文章来源】：合肥工业大学安徽省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
GGT蛋白结构图
合肥工业大学硕士研究生学位论文图1.2茶氨酸的结构式Figure1.2StructureofTheanine茶氨酸不仅可以提升茶汤鲜爽味，还能降低茶的苦涩味，另外，还具有焦糖香，对红茶的香气也有很好的影响。茶氨酸的味觉阈值仅为0.06%，常见的谷氨酸阈值为0.15%，低阈值意味着极低浓度的茶氨酸仍能被轻易感觉到。研究表明茶氨酸没有毒性，且摄取量规定上没有明显限制[25]。糖类与茶氨酸能够形成具有挥发性香味的物质；茶氨酸与谷氨酸、甘氨酸以及丙氨酸等共同作用，能够极大提升食品鲜味；同时，可通过添加茶氨酸来抑制咖啡碱和儿茶素的苦涩味。1.2.3L-茶氨酸的生理功能（1）提高认知学习能力L-茶氨酸能够与神经递质发生相互作用，实验表明，L-茶氨酸能够显著增加大脑相关区域中多巴胺的分泌，同时减少血清素的分泌从而达到提高认知学习能力的效果[26]。Haskell等人报道了茶氨酸能够提高认知学习能力，他们发现通过茶氨酸与咖啡因结合使用后试验组相较于对照组在简单反应时间、数字记忆和句子验证的准确性方面有了明显提高[27]。林雪玲等人通过喂食小鼠一定量的L-茶氨酸并进行回避测试、跳台测试、复杂水迷宫等行为测试，发现L-茶氨酸能够提高小鼠的学习能力、记忆能力以及认知能力，并且提出L-茶氨酸能够活化脑神经递质多巴胺，从而提高小鼠的认知学习能力[28]。（2）保护脑神经流行病学研究表明，饮茶者患中风的可能性显著降低，初步表明L-茶氨酸能对脑神经产生影响。Kakuda等人报道了L-茶氨酸预处理对于侧脑室诱导海马CA1区缺血的实验中能够显著降低缺血神经元的死亡，且呈剂量依赖性[29]。Zukhurova等人进行了大鼠脑缺血再灌注实验，阻断大鼠动脉对于脑部供血30min，其后在不同时间进行再灌注分析脑神经缺损及脑梗面积。研究结果表明，再灌注
茶树细胞或愈伤组织合成茶氨酸。研究者发现该方法难以应用于工业化大规模生产中，主要原因是该方法成本过高，植物细胞生长缓慢，产率低以及分离纯化复杂[50]。（4）微生物酶促合成法目前，常用于合成L-茶氨酸研究中的酶主要有四种，根据其反应性质可分为两类：第一类主要催化L-谷氨酸与乙胺进行合成反应获得L-茶氨酸，需要ATP参与反应，包括谷氨酰胺合成酶和γ-谷氨酰甲胺合成酶；第二类主要催化L-谷氨酰胺与乙胺发生进行酰基转移反应，不需要ATP参与反应，包括谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰基转移酶[15,18]。其反应方程式如图1.3所示。图1.3酶促合成L-茶氨酸的反应方程式Figure1.3ReactionofenzymaticsynthesisofL-theanine①谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶（L-glutaminesynthetase，GS，EC6.3.1.2）催化L-谷氨酸盐与游离的氨在ATP供能的前提下合成L-谷氨酰胺。来源于细菌中的GS能够催化L-谷氨酸与乙胺反应合成L-茶氨酸[51]。相关报道最早出现在1986年，Tachiki等人利用来源于谷氨酸微球菌的GS催化合成茶氨酸[52]。此后，Yamamoto利用来源于Pseudomonastaetrolens的GS进行类似反应，其中酶与底物乙胺的连接活性仅为7%。由于反应需要ATP参与，为了简化ATP补充流程Yamamoto将L-茶氨酸6
【参考文献】：
期刊论文
[1]γ-谷氨酰转肽酶基因工程菌的研究进展[J]. 胡永彬,徐礼生,孙玥,于巧玲. 山东化工. 2019(12)
[2]L-茶氨酸防治脑疾病研究进展[J]. 曾立,肖文军. 茶叶科学. 2019(02)
[3]茶的综合利用产业现状与未来[J]. 屠幼英. 中国茶叶. 2018(12)
[4]重组大肠杆菌表达外源蛋白包涵体复性的研究进展[J]. 牟筱,宗惠,宫皓,杨焱,余四九. 甘肃畜牧兽医. 2018(04)
[5]茶氨酸呈味特征及应用前景[J]. 蔡翔,李延升,杨普香,江新凤. 蚕桑茶叶通讯. 2017(06)
[6]L-theanine: A potential multifaceted natural bioactive amide as health supplement[J]. Rajsekhar Adhikary,Vivekananda Mandal. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2017(09)
[7]PPK和GMAS共表达重组菌株的构建及其在L-茶氨酸合成中的应用[J]. 李元,刘珊,祝俊. 生物工程学报. 2016(12)
[8]重组大肠杆菌高效催化合成L-茶氨酸[J]. 黄锋,唐云平,黄磊,蔡谨,徐志南. 化学工程. 2016(10)
[9]微生物谷氨酰胺转移酶及其在食品工业中的应用[J]. 王美玲. 山东食品发酵. 2015(02)
[10]枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展[J]. 余小霞,田健,刘晓青,伍宁丰. 生物技术通报. 2015(02)
本文编号：3310870
【文章来源】：合肥工业大学安徽省 211工程院校 教育部直属院校
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
GGT蛋白结构图
合肥工业大学硕士研究生学位论文图1.2茶氨酸的结构式Figure1.2StructureofTheanine茶氨酸不仅可以提升茶汤鲜爽味，还能降低茶的苦涩味，另外，还具有焦糖香，对红茶的香气也有很好的影响。茶氨酸的味觉阈值仅为0.06%，常见的谷氨酸阈值为0.15%，低阈值意味着极低浓度的茶氨酸仍能被轻易感觉到。研究表明茶氨酸没有毒性，且摄取量规定上没有明显限制[25]。糖类与茶氨酸能够形成具有挥发性香味的物质；茶氨酸与谷氨酸、甘氨酸以及丙氨酸等共同作用，能够极大提升食品鲜味；同时，可通过添加茶氨酸来抑制咖啡碱和儿茶素的苦涩味。1.2.3L-茶氨酸的生理功能（1）提高认知学习能力L-茶氨酸能够与神经递质发生相互作用，实验表明，L-茶氨酸能够显著增加大脑相关区域中多巴胺的分泌，同时减少血清素的分泌从而达到提高认知学习能力的效果[26]。Haskell等人报道了茶氨酸能够提高认知学习能力，他们发现通过茶氨酸与咖啡因结合使用后试验组相较于对照组在简单反应时间、数字记忆和句子验证的准确性方面有了明显提高[27]。林雪玲等人通过喂食小鼠一定量的L-茶氨酸并进行回避测试、跳台测试、复杂水迷宫等行为测试，发现L-茶氨酸能够提高小鼠的学习能力、记忆能力以及认知能力，并且提出L-茶氨酸能够活化脑神经递质多巴胺，从而提高小鼠的认知学习能力[28]。（2）保护脑神经流行病学研究表明，饮茶者患中风的可能性显著降低，初步表明L-茶氨酸能对脑神经产生影响。Kakuda等人报道了L-茶氨酸预处理对于侧脑室诱导海马CA1区缺血的实验中能够显著降低缺血神经元的死亡，且呈剂量依赖性[29]。Zukhurova等人进行了大鼠脑缺血再灌注实验，阻断大鼠动脉对于脑部供血30min，其后在不同时间进行再灌注分析脑神经缺损及脑梗面积。研究结果表明，再灌注
茶树细胞或愈伤组织合成茶氨酸。研究者发现该方法难以应用于工业化大规模生产中，主要原因是该方法成本过高，植物细胞生长缓慢，产率低以及分离纯化复杂[50]。（4）微生物酶促合成法目前，常用于合成L-茶氨酸研究中的酶主要有四种，根据其反应性质可分为两类：第一类主要催化L-谷氨酸与乙胺进行合成反应获得L-茶氨酸，需要ATP参与反应，包括谷氨酰胺合成酶和γ-谷氨酰甲胺合成酶；第二类主要催化L-谷氨酰胺与乙胺发生进行酰基转移反应，不需要ATP参与反应，包括谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰基转移酶[15,18]。其反应方程式如图1.3所示。图1.3酶促合成L-茶氨酸的反应方程式Figure1.3ReactionofenzymaticsynthesisofL-theanine①谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶（L-glutaminesynthetase，GS，EC6.3.1.2）催化L-谷氨酸盐与游离的氨在ATP供能的前提下合成L-谷氨酰胺。来源于细菌中的GS能够催化L-谷氨酸与乙胺反应合成L-茶氨酸[51]。相关报道最早出现在1986年，Tachiki等人利用来源于谷氨酸微球菌的GS催化合成茶氨酸[52]。此后，Yamamoto利用来源于Pseudomonastaetrolens的GS进行类似反应，其中酶与底物乙胺的连接活性仅为7%。由于反应需要ATP参与，为了简化ATP补充流程Yamamoto将L-茶氨酸6
【参考文献】：
期刊论文
[1]γ-谷氨酰转肽酶基因工程菌的研究进展[J]. 胡永彬,徐礼生,孙玥,于巧玲. 山东化工. 2019(12)
[2]L-茶氨酸防治脑疾病研究进展[J]. 曾立,肖文军. 茶叶科学. 2019(02)
[3]茶的综合利用产业现状与未来[J]. 屠幼英. 中国茶叶. 2018(12)
[4]重组大肠杆菌表达外源蛋白包涵体复性的研究进展[J]. 牟筱,宗惠,宫皓,杨焱,余四九. 甘肃畜牧兽医. 2018(04)
[5]茶氨酸呈味特征及应用前景[J]. 蔡翔,李延升,杨普香,江新凤. 蚕桑茶叶通讯. 2017(06)
[6]L-theanine: A potential multifaceted natural bioactive amide as health supplement[J]. Rajsekhar Adhikary,Vivekananda Mandal. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2017(09)
[7]PPK和GMAS共表达重组菌株的构建及其在L-茶氨酸合成中的应用[J]. 李元,刘珊,祝俊. 生物工程学报. 2016(12)
[8]重组大肠杆菌高效催化合成L-茶氨酸[J]. 黄锋,唐云平,黄磊,蔡谨,徐志南. 化学工程. 2016(10)
[9]微生物谷氨酰胺转移酶及其在食品工业中的应用[J]. 王美玲. 山东食品发酵. 2015(02)
[10]枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展[J]. 余小霞,田健,刘晓青,伍宁丰. 生物技术通报. 2015(02)
本文编号：3310870
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