改造热葡糖苷酶地芽孢杆菌高效生产核黄素
发布时间：2021-08-09 03:18
相对于嗜温微生物的常温发酵工艺,在工业生产中使用嗜热微生物进行高温发酵生产,具有提高生化反应速率、降低染菌风险、减少发酵冷却能耗等潜在优势。热葡糖苷酶地芽孢杆菌的最适生长温度为60℃,生长代时16分钟,并且能够充分利用木质纤维素水解物,因此是高温微生物发酵的优秀底盘候选菌株。热葡糖苷酶地芽孢杆菌作为生产菌株能够将其耐高温、生长快速、利用廉价碳源等特性,与工业生产中减少冷却水的使用、降低染菌风险、缩短发酵周期和降低发酵原辅料成本等多种需求相互契合,具有极大地开发价值。本论文利用耐热绿色荧光蛋白作为反筛标记,开发了一种快速便捷的地芽孢杆菌遗传操作方法。使用该方法对热葡糖苷酶地芽孢杆菌进行代谢工程改造,实现了产量从无到有,从低到高的高温核黄素生产菌株的开发。在热葡糖苷酶地芽孢杆菌中引入异源核黄素生物合成基因簇,获得第一代核黄素菌株Rib-Gtd,核黄素产量达28.7 mg/L;对ribCGtg进行点突变,获得降低核黄素细胞消耗的第二代核黄素菌株Rib-Gtdl,核黄素产量达84.6mg/L;敲除嘌吟途径的调控蛋白PurRGtg解除对嘌呤途径的抑制,获得第三代核黄素菌株Rib-Gtd2,核黄素...
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．８依赖ＦＭＮ的核糖体开关模型，六个茎环结构被标记为Ｐ１－Ｐ６１３９１??Ｆｉｇ．?１．８?Ｍｏｄｅｌ?ｆｏｒ?ｔｈｅ?ＦＭＮ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ?ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ，?ｔｈｅ?ｓｉｘ??
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７１＾１１１八４２６中发现一个受麦芽糖诱导的启动子??Ｐ＃７Ｗ（在含有ａ－淀粉酶的时候也能受直链淀粉诱导）。在基因组上表达的时，几乎无渗??漏表达。当放到多拷贝质粒上时，略有渗漏。培养２０小时后，启动子强度相比没有诱??导的对照提高６倍左右。该启动子受到Ｄ－木糖和Ｌ－阿拉伯糖抑制［１２３］。??Ｎｃｏ＼?ｓＷｅｆｓｕｒＰ??Ｎｓｐｌｓｉｔｅ?ＥｃｏＲ＼?ｓｉｔｅ?ｓｔａｒｔ?ｃｏｄｏｎ??．?Ｉ?ｋ?＾?ｓｕｒＡ？?ｒｅｇｉｏｎ??－Ｌ－ＰＯ?ｓｕｒＴ?￣Ｈ￣ＩＱ—Ｉ—??图１．１２蔗糖诱导操纵子的调控区域ｌ１２２ｉ??Ｆｉｇ．?１．１２?Ｔｈｅ?ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｒｅｇｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｕｃｒｏｓｅ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｏｐｅｒｏｎ?ｉｓ?ｓｃｈｅｍａｔｉｚｅｄ！１２２＇??总的来说，目前地芽孢杆菌虽然能够使用同源重组方法进行基因编辑，但是由于没??有合适的筛选标记，地芽孢杆菌基因编辑仍然费时费力，严重制约了地芽孢杆菌的遗传??代谢研宄。??１．４本论文的立题依据、研宄内容、目标和意义??作为ＦＭＮ和ＦＡＤ的直接前体，核黄素是所有细菌、植物和动物细胞生理必需的重??要组成部分，目前已广泛应用于制药、化妆品、人体及动物营养等领域［７］。由于核黄素??具有广泛的应用价值，因此核黄素的需求量逐年增多，到２０１５年全球的核黄素年需求??量己达到９０００吨，而且每年有６％左右的需求增长［８］。目前，核黄素化学合成法已经完??
【参考文献】：
期刊论文
[1]在枯草芽孢杆菌中表达B.cereus ATCC14579的异源核黄素操纵子提高核黄素产量（英文）[J]. 段云霞,陈涛,陈洵,王靖宇,赵学明. Chinese Journal of Chemical Engineering. 2010(01)
[2]hprK基因敲除及对其枯草芽孢杆菌核黄素发酵的影响[J]. 张帆,宋辉,班睿. 生物工程学报. 2006(04)
博士论文
[1]产核黄素Bacillus subtilis中心代谢途径代谢工程和比较基因组学[D]. 王智文.天津大学 2011
本文编号：3331254
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．８依赖ＦＭＮ的核糖体开关模型，六个茎环结构被标记为Ｐ１－Ｐ６１３９１??Ｆｉｇ．?１．８?Ｍｏｄｅｌ?ｆｏｒ?ｔｈｅ?ＦＭＮ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ?ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ，?ｔｈｅ?ｓｉｘ??
华东理工大学硕士学位论文?第１５页??…?ｇｄｈ?ＧＩｕｃｏｎｏ－１，５－?…??Ｇ，ＵＣ〇ＳＣ????ｌａｃｔｏｎｅ????Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ??ｐｇｉ?ｇｎｔｋ??＾?＾?ＧＩｕｃｏｎｏ－１，５－?ｙｋｇＢ??Ｇｌｕｃ〇Ｓｅ－６Ｐ?＾?ｌａｃｔｏｎｅ－６Ｐ??？?Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ－６Ｐ??１??Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６Ｐ？．?＾??ｉ?＿??？??Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙ－３Ｐ???？；?ＲｉｂｕＩｏｓｅ－５Ｐ??图１．９枯草杆菌的氧化戊糖磷酸途径及其相关反应。??Ｆｉｇ．?１．９?Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ?ｐｅｎｔｏｓｅ?ｐｈｏｓｐｈａｔｅ?ｐａｔｈｗａｙ?ａｎｄ?ｒｅｌａｔｅｄ?ｒｅａｃｔｉｏｎｓ?ｏｆＳ．?ｓｕｂｔｉｌｉｓ．??１．２．１．５增加能量供应??使用枯草芽孢杆菌生产核黄素的反应方程式为３?Ｒｕ５Ｐ?＋?Ｇｌｙ?＋?１４?ＡＴＰ?＋?２Ｑ?＋??２ＮＡＤＰＨ?＋?３Ｎ?—ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ?＋?３ＮＡＤＨ?＋?２ｆｏｒｍａｔｅ。由反应方程式得知，需要消耗１４分??子ＡＴＰ才能产生一分子核黄素，因此细胞ＡＴＰ供能不足可能是限制核黄素生产的重要??因素。ＡＴＰ由还原力ＮＡＤＨ产生，与呼吸链的氧化磷酸化相关。由于呼吸链上同时存??在能量耦合效率低的细胞色素ｂｄ氧化酶（由ｃｙｄ基因编码）和耦合效率高的ａａ３氧化??酶，Ｚａｍｂｏｎｉ等人通过敲除ｃｙｄ基因改变呼吸链中的电子流向，降低ｃｙｄ缺失株的维持??能。最终使得产量由对照组的８．９ｇ／Ｌ提高到１２．３?ｇ／Ｌ。Ｓｉｍｏｎ?Ｔｉｎｎｉｅｒ等人通过敲除枯草??芽孢杆菌的基因后发现，和野生型菌株相比，敲除株的维持能下降，乙酸的含量下??降
７１＾１１１八４２６中发现一个受麦芽糖诱导的启动子??Ｐ＃７Ｗ（在含有ａ－淀粉酶的时候也能受直链淀粉诱导）。在基因组上表达的时，几乎无渗??漏表达。当放到多拷贝质粒上时，略有渗漏。培养２０小时后，启动子强度相比没有诱??导的对照提高６倍左右。该启动子受到Ｄ－木糖和Ｌ－阿拉伯糖抑制［１２３］。??Ｎｃｏ＼?ｓＷｅｆｓｕｒＰ??Ｎｓｐｌｓｉｔｅ?ＥｃｏＲ＼?ｓｉｔｅ?ｓｔａｒｔ?ｃｏｄｏｎ??．?Ｉ?ｋ?＾?ｓｕｒＡ？?ｒｅｇｉｏｎ??－Ｌ－ＰＯ?ｓｕｒＴ?￣Ｈ￣ＩＱ—Ｉ—??图１．１２蔗糖诱导操纵子的调控区域ｌ１２２ｉ??Ｆｉｇ．?１．１２?Ｔｈｅ?ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｒｅｇｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｕｃｒｏｓｅ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｏｐｅｒｏｎ?ｉｓ?ｓｃｈｅｍａｔｉｚｅｄ！１２２＇??总的来说，目前地芽孢杆菌虽然能够使用同源重组方法进行基因编辑，但是由于没??有合适的筛选标记，地芽孢杆菌基因编辑仍然费时费力，严重制约了地芽孢杆菌的遗传??代谢研宄。??１．４本论文的立题依据、研宄内容、目标和意义??作为ＦＭＮ和ＦＡＤ的直接前体，核黄素是所有细菌、植物和动物细胞生理必需的重??要组成部分，目前已广泛应用于制药、化妆品、人体及动物营养等领域［７］。由于核黄素??具有广泛的应用价值，因此核黄素的需求量逐年增多，到２０１５年全球的核黄素年需求??量己达到９０００吨，而且每年有６％左右的需求增长［８］。目前，核黄素化学合成法已经完??
【参考文献】：
期刊论文
[1]在枯草芽孢杆菌中表达B.cereus ATCC14579的异源核黄素操纵子提高核黄素产量（英文）[J]. 段云霞,陈涛,陈洵,王靖宇,赵学明. Chinese Journal of Chemical Engineering. 2010(01)
[2]hprK基因敲除及对其枯草芽孢杆菌核黄素发酵的影响[J]. 张帆,宋辉,班睿. 生物工程学报. 2006(04)
博士论文
[1]产核黄素Bacillus subtilis中心代谢途径代谢工程和比较基因组学[D]. 王智文.天津大学 2011
本文编号：3331254
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