增强染料脱色过氧化物酶TfuDyP在重组大肠杆菌中的催化活性
发布时间：2021-08-11 20:12
目前,染料脱色过氧化物酶家族（Dye-decolorizing peroxidases,DyPs）因能够对多种染料废水进行脱色而备受关注。但是由于受辅基血红素的限制,该类蛋白在异源表达时活性相对较低,因此,尽可能提高酶蛋白与辅基血红素的结合成为关键。本文的研究对象是褐色嗜热裂孢菌（Thermobifida fusca）的染料脱色过氧化物酶（Dye-decolorizing peroxidase from Thermobifida fusca,TfuDyP）,通过与控制大肠杆菌血红素C5合成途径中的关键酶基因共表达,在提高血红素含量的同时,增强酶与辅基血红素的结合,最终提高酶活性。进而选择三种分属于蒽醌类、双偶氮类、三苯甲烷类的难降解染料:活性蓝19、刚果红、溴甲酚绿,探究TfuDyP脱色能力,并选择脱色效果显著的溴甲酚绿作为底物,优化其反应条件。由于在大肠杆菌中异源表达的TfuDyP属胞内酶,酶的获取需经过破碎离心,不利于工业化的应用,因而采用渗透压蛋白Y（OsmY）蛋白作为载体与TfuDyP融合表达,介导重组蛋白TfuDyP的胞外分泌。主要研究内容与结果如下:（1）过表达血红素合成途...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
血红素分子结构式Fig1-1Molecularstructureofheme
第一章绪论5图1-2血红素合成途径[46]Fig1-2Hemesynthesispathway1.2.3血红素与染料脱色过氧化物酶的关系血红素是以卟啉环为骨架与一分子的亚铁离子通过化学键形成的络合物，能够对细胞和机体的生命活动的正常进行起重要的调控作用，且在体内分布广泛，在正常情况下，血红素主要是以辅基的形式与蛋白进行结合，存在与机体内，游离形态的血红素含量较低。染料脱色过氧化物酶家族（DyPs）作为以血红素为辅基的过氧化物酶家族中的一个新家族成员，对于多种染料具有脱色能力。该类酶蛋白与其他过氧化物家族成员相似，均是由是多肽和血红素通过非共价键形式进行紧密结合[19]。DyP只有在脱辅基蛋白与血红素结合之后构成全蛋白，并以过氧化氢为电子受体，才能发挥生物学功能[47]。目前，血红蛋白的最新研究表明辅基血红素的充足供应是血红蛋白产生生物功能性的重要方面[48,49]，这些辅基的水平不足导致其酶活性降低[50,51]。因此，在染料脱色过氧化物酶（DyP）得到高效表达的同时，尽可能提高酶与血红素的结合显得尤为重要。1.3染料脱色过氧化物酶对染料的降解1.3.1染料废水的简介染料是一种附着在纤维和其他材料上，并使其获得颜色的物质，大多数的染料均可以从自然界中获得，也有少数通过化学反应人工合成。染料不仅应用于各种纺织纤维的染色，同时广泛应用于造纸、食品、化妆品、皮革、塑料等工业和医药行业。随着经济的飞速发展，全球对于染料的需求越来越大，目前全球染料年产量多达700万吨，其中我国是全球染料生产和消费第一大国，也正因此印染纺织业排水量大增，与此同时有大量环境有害型的染料废水被排放到河流水域中，导致自然水域生态的破坏。我国生产的染料主要以三种染料为主，即分散染料、活性染料和硫化染料，其中分散染料由于其具
江南大学硕士学位论文162.2.3.2Fe2+外源添量的优化FeCl2用无菌水配制并过滤除菌，接种时在培养基中外源添加终浓度为0、10、20、30、40、50、60μmolL-1的FeCl2，重组菌诱导表达方法表达后，根据TfuDyP酶活找出最适宜添加量。2.3检测方法2.3.1胞内血红素浓度的测定用质量分数0.25%的Na2CO3溶液配制不同浓度的血红素样品，后用酶标仪测定荧光值，制作血红素浓度的标准曲线，如图2-1。血红素浓度利用荧光法来检测，具体参考陈丹园[77]胞内血红素检测方法。图2-1血红素浓度标准曲线Fig.2-1Thestandardcurveofhemeconcentration2.3.2卟啉类物质定性的测定通过有机提取对卟啉类物质进行定性分析[78]：取15mL诱导后的菌体上清与冰醋酸：乙酸乙酯（1:4）混合液体混合振荡，离心后将有机相吸出与3molL-1盐酸混合振荡，离心取盐酸层进行全波长扫描。2.3.3蛋白溶液浓度测定使用考马斯染料的Bradford法蛋白质定量试剂盒，具体操作步骤参考TaKaRaBradfordProteinAssayKit说明书。蛋白溶液浓度标准曲线如图2-2。
【参考文献】：
期刊论文
[1]烟管孔菌G11对活性染料的脱色[J]. 张富美,侯瑞. 菌物学报. 2019(09)
[2]Fur过表达对大肠杆菌血红素合成的影响[J]. 李蒙蒙,王雨萱,唐蕾. 食品与发酵工业. 2019(16)
[3]褐色嗜热裂孢菌脱色过氧化物酶的表达及发酵条件优化[J]. 朱竹兵,孙亚武,唐蕾. 食品与发酵工业. 2019(13)
[4]关键酶基因的过表达与环境因素对大肠杆菌血红素合成的调控[J]. 陈丹园,沈云杰,杨燕,唐蕾. 食品与发酵工业. 2018(11)
[5]一株新的高效偶氮染料脱色菌Paenibacillus dendritiformis GGJ7及其脱色作用[J]. 甘国娟,田红灯,潘永龙,Asit Mazumder,潘响亮,梁岩. 应用与环境生物学报. 2018(03)
[6]杂色云芝漆酶对溴酚蓝的高效降解[J]. 余昭琴,贾红华,王婷婷,周华,韦萍. 化工环保. 2015(02)
[7]染料废水污染现状及处理方法研究进展[J]. 陈文华,李刚,许方程,泮琇,温玲宁,都林娜. 浙江农业科学. 2014(02)
[8]一种新的DyP-type过氧化物酶在大肠杆菌中的重组表达、纯化及鉴定[J]. 汪立群,Alan K.Chang,袁文杰,白凤武. 生物工程学报. 2013(06)
[9]共转化大肠杆菌hemA和hemL基因增强小麦过氧化物酶WP1在原核系统中的功能性表达[J]. 张超,单丽伟,苏帅坤,南艳妮,郭忠玉,范三红. 生物工程学报. 2012(07)
[10]染料废水处理技术及研究趋势[J]. 陈跃. 黄石理工学院学报. 2011(01)
硕士论文
[1]大肠杆菌血红素合成途径关键酶基因的表达与调控[D]. 陈丹园.江南大学 2018
[2]固定化海洋细菌漆酶对纺织印染废水的脱色研究[D]. 王瑞色.大连交通大学 2014
[3]大肠杆菌血红素合成途径的改造与调控对5-氨基乙酰丙酸积累和菌体代谢的影响[D]. 李芳芳.山东大学 2014
本文编号：3336818
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
血红素分子结构式Fig1-1Molecularstructureofheme
第一章绪论5图1-2血红素合成途径[46]Fig1-2Hemesynthesispathway1.2.3血红素与染料脱色过氧化物酶的关系血红素是以卟啉环为骨架与一分子的亚铁离子通过化学键形成的络合物，能够对细胞和机体的生命活动的正常进行起重要的调控作用，且在体内分布广泛，在正常情况下，血红素主要是以辅基的形式与蛋白进行结合，存在与机体内，游离形态的血红素含量较低。染料脱色过氧化物酶家族（DyPs）作为以血红素为辅基的过氧化物酶家族中的一个新家族成员，对于多种染料具有脱色能力。该类酶蛋白与其他过氧化物家族成员相似，均是由是多肽和血红素通过非共价键形式进行紧密结合[19]。DyP只有在脱辅基蛋白与血红素结合之后构成全蛋白，并以过氧化氢为电子受体，才能发挥生物学功能[47]。目前，血红蛋白的最新研究表明辅基血红素的充足供应是血红蛋白产生生物功能性的重要方面[48,49]，这些辅基的水平不足导致其酶活性降低[50,51]。因此，在染料脱色过氧化物酶（DyP）得到高效表达的同时，尽可能提高酶与血红素的结合显得尤为重要。1.3染料脱色过氧化物酶对染料的降解1.3.1染料废水的简介染料是一种附着在纤维和其他材料上，并使其获得颜色的物质，大多数的染料均可以从自然界中获得，也有少数通过化学反应人工合成。染料不仅应用于各种纺织纤维的染色，同时广泛应用于造纸、食品、化妆品、皮革、塑料等工业和医药行业。随着经济的飞速发展，全球对于染料的需求越来越大，目前全球染料年产量多达700万吨，其中我国是全球染料生产和消费第一大国，也正因此印染纺织业排水量大增，与此同时有大量环境有害型的染料废水被排放到河流水域中，导致自然水域生态的破坏。我国生产的染料主要以三种染料为主，即分散染料、活性染料和硫化染料，其中分散染料由于其具
江南大学硕士学位论文162.2.3.2Fe2+外源添量的优化FeCl2用无菌水配制并过滤除菌，接种时在培养基中外源添加终浓度为0、10、20、30、40、50、60μmolL-1的FeCl2，重组菌诱导表达方法表达后，根据TfuDyP酶活找出最适宜添加量。2.3检测方法2.3.1胞内血红素浓度的测定用质量分数0.25%的Na2CO3溶液配制不同浓度的血红素样品，后用酶标仪测定荧光值，制作血红素浓度的标准曲线，如图2-1。血红素浓度利用荧光法来检测，具体参考陈丹园[77]胞内血红素检测方法。图2-1血红素浓度标准曲线Fig.2-1Thestandardcurveofhemeconcentration2.3.2卟啉类物质定性的测定通过有机提取对卟啉类物质进行定性分析[78]：取15mL诱导后的菌体上清与冰醋酸：乙酸乙酯（1:4）混合液体混合振荡，离心后将有机相吸出与3molL-1盐酸混合振荡，离心取盐酸层进行全波长扫描。2.3.3蛋白溶液浓度测定使用考马斯染料的Bradford法蛋白质定量试剂盒，具体操作步骤参考TaKaRaBradfordProteinAssayKit说明书。蛋白溶液浓度标准曲线如图2-2。
【参考文献】：
期刊论文
[1]烟管孔菌G11对活性染料的脱色[J]. 张富美,侯瑞. 菌物学报. 2019(09)
[2]Fur过表达对大肠杆菌血红素合成的影响[J]. 李蒙蒙,王雨萱,唐蕾. 食品与发酵工业. 2019(16)
[3]褐色嗜热裂孢菌脱色过氧化物酶的表达及发酵条件优化[J]. 朱竹兵,孙亚武,唐蕾. 食品与发酵工业. 2019(13)
[4]关键酶基因的过表达与环境因素对大肠杆菌血红素合成的调控[J]. 陈丹园,沈云杰,杨燕,唐蕾. 食品与发酵工业. 2018(11)
[5]一株新的高效偶氮染料脱色菌Paenibacillus dendritiformis GGJ7及其脱色作用[J]. 甘国娟,田红灯,潘永龙,Asit Mazumder,潘响亮,梁岩. 应用与环境生物学报. 2018(03)
[6]杂色云芝漆酶对溴酚蓝的高效降解[J]. 余昭琴,贾红华,王婷婷,周华,韦萍. 化工环保. 2015(02)
[7]染料废水污染现状及处理方法研究进展[J]. 陈文华,李刚,许方程,泮琇,温玲宁,都林娜. 浙江农业科学. 2014(02)
[8]一种新的DyP-type过氧化物酶在大肠杆菌中的重组表达、纯化及鉴定[J]. 汪立群,Alan K.Chang,袁文杰,白凤武. 生物工程学报. 2013(06)
[9]共转化大肠杆菌hemA和hemL基因增强小麦过氧化物酶WP1在原核系统中的功能性表达[J]. 张超,单丽伟,苏帅坤,南艳妮,郭忠玉,范三红. 生物工程学报. 2012(07)
[10]染料废水处理技术及研究趋势[J]. 陈跃. 黄石理工学院学报. 2011(01)
硕士论文
[1]大肠杆菌血红素合成途径关键酶基因的表达与调控[D]. 陈丹园.江南大学 2018
[2]固定化海洋细菌漆酶对纺织印染废水的脱色研究[D]. 王瑞色.大连交通大学 2014
[3]大肠杆菌血红素合成途径的改造与调控对5-氨基乙酰丙酸积累和菌体代谢的影响[D]. 李芳芳.山东大学 2014
本文编号：3336818
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