新型靶向DEK适配体治疗类风湿性关节炎的研究
发布时间：2021-08-24 15:17
研究目的:本课题将一种特异性结合DEK蛋白的适配体DTA进行化学修饰以提高其体内稳定性,并通过体外细胞实验和体内动物实验考察修饰型靶向DEK适配体对类风湿性关节炎的治疗效果,以筛选出最佳新型靶向DEK适配体。研究方法:RNAStructure5.7软件模拟DTA最佳二级结构,并根据其二级结构特征拟在其脱氧核糖的2’位修饰甲氧基、3’端修饰反式脱氧胸苷和5’端修饰胆固醇。变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳考察修饰的靶向DEK适配体在DNase I、含2%BSA的RPMI 1640培养基及90%小鼠血清中的稳定性;生物膜干涉技术研究靶向DEK适配体与DEK蛋白间的结合动力学。CCK-8法检测靶向DEK适配体对单核巨噬细胞RAW264.7活性的影响;Percoll不连续密度梯度离心法从小鼠体内提取中性粒细胞;用LPS或PMA活化提取的中性粒细胞,并通过细胞免疫荧光实验和测定细胞外dsDNA含量考察靶向DEK适配体对中性粒细胞外陷阱（NETs）形成的影响;LPS刺激RAW264.7细胞建立炎症模型,通过免疫印迹法检测RAW264.7细胞刺激后DEK蛋白表达量变化,并用ELISA检测细胞上清中TNF-α...
【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２?ＤＥＫ适配体的修饰方法及作用机制图??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｍｅｔｈｏｄ?ａｎｄ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ＤＥＫ?ａｐｔａｍｅｒｓ??
?第二章适配体的表征???Ｗ?＿?１?２?２?４?；?６?７?Ｓ?＆?１０?１１?１２??Ａ｜？Ｇ？?〇？０？？〇０〇０??Ｂ?０？０〇＠〇？？〇〇〇〇??ｃ?？？？〇？〇？？〇〇〇〇??□？〇？〇？〇？？〇〇〇〇??Ｅ?？？？〇？〇？？〇〇〇〇??Ｆ?？〇？〇？〇？？〇〇〇〇??〇？〇？〇？〇？？〇〇〇〇??Ｈｌ（Ｔ）Ｑ００（ｒ）０（？）０〇〇〇〇??图２．１?ＢＬＩ动力学实验中样品的设置??Ｂ：动力学缓冲液；Ｌ：生物素化适配体；Ｒ：再生溶液；粉色孔：ＤＥＫ重组蛋白溶液??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｓａｍｐｌｅ?ｓｅａｉｐｓ?ｆｏｒ?ＢＬＩ?ｋｉｎｅｔｉｃｓ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ??Ｂ：?ｋｉｎｅｔｉｃ?ｂｕｆｆｅｒ；?Ｌ：?ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ?ａｐｔａｍｅｒｓ；?Ｒ：?ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ；?ｐｉｎｋ?ｗｅｌｌ：?ＤＥＫ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ??ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ??３实验结果与讨论??３．１?ＤＴＡ二级结构??寻找适配体的最佳修饰方法以及预测适配体与ＤＥＫ蛋白的结合位点，首要??步骤之一是预测其二级结构，ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ软件能根据碱基配对概率预测ＲＮＡ??和ＤＮＡ的二级结构【８１］。该软件通过最小自由能原理，当达到最小自由能时，核??酸分子调整结构到达最为稳定的状态，此时核酸分子的二级结构最接近真实的??结构。根据该方法，可以获得ＤＴＡ最优的二级结构（图２．２），并根据其二级结??构制定修饰方案（表２．１?）。??１４??
?第二章适配体的表征???５－?Ｇ?Ｔ?■－?Ｔ、Ａ??Ｇ?—?Ｇ?＿?Ｇ??Ａ??ｃ?—?ｃ?ｃ??ｉ?＼?，Ｔ??ａ?厂Ａ?１０??Ｃ??２０??Ａ?，ｃ、＇??ＴＴＧ?Ｃ?—￣?Ｔ?Ｇ?＂?＼??！丨丨?！?Ｉ?Ｉ?Ｇ??Ａ?Ａ?Ｃ、?Ａ?Ｃ?ｃ??Ａ?Ｔ??Ａ??３０??Ｔ??４０?Ａ??３，?Ｇ??ｔｆＳ?？?－Ｊ?ｉｆ?ｎｓ??图２．２?ＤＴＡ的二级结构??Ｆｉｇｕｒｅ?２．２?Ｔｌｉｅ?ｓｅｃｏｎｄａｒｙ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＤＴＡ??３．２适配体对ＤＮａｓｅ?Ｉ的稳定性??脱氧核糖核酸酶Ｉ?（ＤＮａｓｅ?Ｉ），是核酸内切酶的一种，分子量约为３２?ＫＤａ，??可以将单链或双链ＤＮＡ随机分解成单个脱氧核苷酸或寡聚脱氧核苷酸，其活性??依赖于钙离子并能被镁离子或二价锰离子激活［８２］。在镁离子存在时，ＤＮａｓｅ丨能??在ＤＮＡ任意位点上随机地产生切口。Ｐｉｅｒｒｅ?Ｊ等人测定小鼠血清中的镁离子浓??度为２．８±０．１ｍｇ／ｄＬ［８３］，因此，在本实验中，采用此浓度的镁离子来更好的模拟??适配体在体内的酶解过程。??变性尿素聚丙烯酰胺凝胶在核苷酸碱基配对抑制剂（尿素或甲酰胺）存在时??聚合而成，在温度为４５－５５°Ｃ的条件下，其可以用于非结构化分离和纯化单链??ＤＮＡ?（ＲＮＡ）片段ｔ８４Ｌ在变性凝胶运行过程中，迁移率与核酸的分子量有关，??而与空间结构无关１８５］，因此可用于核酸适配体的检测。适配体在ＤＮａｓｅｌ存在条??件下的电泳图如图２．３所示，共孵育后完整适配体所占比例结果见表２．３。??１５??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Rheumatoid arthritis: pathological mechanisms and modern pharmacologic therapies[J]. Qiang Guo,Yuxiang Wang,Dan Xu,Johannes Nossent,Nathan J.Pavlos,Jiake Xu. Bone Research. 2018(02)
[2]MicroCT国内外技术、产业发展现状及应用趋势的研究[J]. 谢俊祥,张琳. 中国医疗器械信息. 2016(03)
[3]类风湿性关节炎发病机制的研究进展[J]. 周静,张弦,钱海兵. 贵阳中医学院学报. 2014(05)
[4]VEGF在类风湿性关节炎血管形成中的作用及其相关研究进展[J]. 达古拉,李鸿斌. 医学综述. 2012(05)
[5]蛋白质免疫印迹技术的实验研究[J]. 张燕婉,叶珏,时那,孟宪敏,王来元. 实验技术与管理. 2008(10)
本文编号：3360234
【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２?ＤＥＫ适配体的修饰方法及作用机制图??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｍｅｔｈｏｄ?ａｎｄ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ＤＥＫ?ａｐｔａｍｅｒｓ??
?第二章适配体的表征???Ｗ?＿?１?２?２?４?；?６?７?Ｓ?＆?１０?１１?１２??Ａ｜？Ｇ？?〇？０？？〇０〇０??Ｂ?０？０〇＠〇？？〇〇〇〇??ｃ?？？？〇？〇？？〇〇〇〇??□？〇？〇？〇？？〇〇〇〇??Ｅ?？？？〇？〇？？〇〇〇〇??Ｆ?？〇？〇？〇？？〇〇〇〇??〇？〇？〇？〇？？〇〇〇〇??Ｈｌ（Ｔ）Ｑ００（ｒ）０（？）０〇〇〇〇??图２．１?ＢＬＩ动力学实验中样品的设置??Ｂ：动力学缓冲液；Ｌ：生物素化适配体；Ｒ：再生溶液；粉色孔：ＤＥＫ重组蛋白溶液??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｓａｍｐｌｅ?ｓｅａｉｐｓ?ｆｏｒ?ＢＬＩ?ｋｉｎｅｔｉｃｓ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ??Ｂ：?ｋｉｎｅｔｉｃ?ｂｕｆｆｅｒ；?Ｌ：?ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ?ａｐｔａｍｅｒｓ；?Ｒ：?ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ；?ｐｉｎｋ?ｗｅｌｌ：?ＤＥＫ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ??ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ??３实验结果与讨论??３．１?ＤＴＡ二级结构??寻找适配体的最佳修饰方法以及预测适配体与ＤＥＫ蛋白的结合位点，首要??步骤之一是预测其二级结构，ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ软件能根据碱基配对概率预测ＲＮＡ??和ＤＮＡ的二级结构【８１］。该软件通过最小自由能原理，当达到最小自由能时，核??酸分子调整结构到达最为稳定的状态，此时核酸分子的二级结构最接近真实的??结构。根据该方法，可以获得ＤＴＡ最优的二级结构（图２．２），并根据其二级结??构制定修饰方案（表２．１?）。??１４??
?第二章适配体的表征???５－?Ｇ?Ｔ?■－?Ｔ、Ａ??Ｇ?—?Ｇ?＿?Ｇ??Ａ??ｃ?—?ｃ?ｃ??ｉ?＼?，Ｔ??ａ?厂Ａ?１０??Ｃ??２０??Ａ?，ｃ、＇??ＴＴＧ?Ｃ?—￣?Ｔ?Ｇ?＂?＼??！丨丨?！?Ｉ?Ｉ?Ｇ??Ａ?Ａ?Ｃ、?Ａ?Ｃ?ｃ??Ａ?Ｔ??Ａ??３０??Ｔ??４０?Ａ??３，?Ｇ??ｔｆＳ?？?－Ｊ?ｉｆ?ｎｓ??图２．２?ＤＴＡ的二级结构??Ｆｉｇｕｒｅ?２．２?Ｔｌｉｅ?ｓｅｃｏｎｄａｒｙ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＤＴＡ??３．２适配体对ＤＮａｓｅ?Ｉ的稳定性??脱氧核糖核酸酶Ｉ?（ＤＮａｓｅ?Ｉ），是核酸内切酶的一种，分子量约为３２?ＫＤａ，??可以将单链或双链ＤＮＡ随机分解成单个脱氧核苷酸或寡聚脱氧核苷酸，其活性??依赖于钙离子并能被镁离子或二价锰离子激活［８２］。在镁离子存在时，ＤＮａｓｅ丨能??在ＤＮＡ任意位点上随机地产生切口。Ｐｉｅｒｒｅ?Ｊ等人测定小鼠血清中的镁离子浓??度为２．８±０．１ｍｇ／ｄＬ［８３］，因此，在本实验中，采用此浓度的镁离子来更好的模拟??适配体在体内的酶解过程。??变性尿素聚丙烯酰胺凝胶在核苷酸碱基配对抑制剂（尿素或甲酰胺）存在时??聚合而成，在温度为４５－５５°Ｃ的条件下，其可以用于非结构化分离和纯化单链??ＤＮＡ?（ＲＮＡ）片段ｔ８４Ｌ在变性凝胶运行过程中，迁移率与核酸的分子量有关，??而与空间结构无关１８５］，因此可用于核酸适配体的检测。适配体在ＤＮａｓｅｌ存在条??件下的电泳图如图２．３所示，共孵育后完整适配体所占比例结果见表２．３。??１５??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Rheumatoid arthritis: pathological mechanisms and modern pharmacologic therapies[J]. Qiang Guo,Yuxiang Wang,Dan Xu,Johannes Nossent,Nathan J.Pavlos,Jiake Xu. Bone Research. 2018(02)
[2]MicroCT国内外技术、产业发展现状及应用趋势的研究[J]. 谢俊祥,张琳. 中国医疗器械信息. 2016(03)
[3]类风湿性关节炎发病机制的研究进展[J]. 周静,张弦,钱海兵. 贵阳中医学院学报. 2014(05)
[4]VEGF在类风湿性关节炎血管形成中的作用及其相关研究进展[J]. 达古拉,李鸿斌. 医学综述. 2012(05)
[5]蛋白质免疫印迹技术的实验研究[J]. 张燕婉,叶珏,时那,孟宪敏,王来元. 实验技术与管理. 2008(10)
本文编号：3360234
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/hxgylw/3360234.html
最近更新
教材专著
