异源合成龙涎香醇的大肠杆菌构建
发布时间：2021-09-07 02:46
龙涎香醇是一种三环三萜化合物,是名贵天然动物香料和传统中药龙涎香中的主要成分,是龙涎香香气的来源,同时也是发挥镇痛、抗炎等药效的活性成分。龙涎香醇一般在高端香水市场中被应用,由于其在自然界中十分难得和化学合成难度大等原因,使龙涎香醇在香水工业和医药方面上的应用受到了制约。目前,以鲨烯为底物,通过D377C SHC和BmeTC的两步体外酶催化反应而生物合成龙涎香醇已经得到实现。大肠杆菌作为模式微生物,是良好的外源基因表达载体,同时其內源的类异戊二烯途径（MEP途径）也为萜类化合物的异源合成提供了分子基础,为龙涎香醇在大肠杆菌中的异源合成提供了可能性。在本文中,首先通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术将鲨烯合酶基因erg9整合到大肠杆菌基因组上,构建出具有鲨烯合成能力的大肠杆菌工程菌,摇瓶发酵后鲨烯产量为18.43mg/L。通过引入拟南芥来源的GPP合酶,鲨烯产量提高了1.17倍,达到21.54mg/L。在大肠杆菌中构建出鲨烯合成途径后,将D377C SHC基因和BmeTC基因连接在质粒载体上表达,并导入大肠杆菌工程菌中,得到具有完整的龙涎香醇合成途径的大肠杆菌工程菌,实现龙涎香...
【文章来源】：天津大学天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
龙涎香醇的结构式Figure1-1Chemicalstructureof(+)-ambrein
50，其分子结构式如图1-2所示，最初从鲨鱼肝部中提取得到因而得名鲨烯。鲨烯是很多三萜化合物在生物合成途径中共同的前体物质，例如具有抗肿瘤活性的白桦脂酸等五环三萜化合物、原人参二醇等四环三萜化合物[15]。图 1-2 鲨烯的结构式Figure1-2 Chemical structure of squalene2013年，Ueda等[16]在鉴定Bacillus megaterium来源的tetraprenyl-β-curcumene环化酶（BmeTC）活性的同时，开辟出了一条以鲨烯为底物、包含两步酶催化反应的龙涎香醇合成路径，如图1-3所示。定点突变酸热脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus acidocaldarius来源的鲨烯-藿烯环化酶（SHC）所得到的多个突变体中，D377C SHC是将SHC氨基酸残基序列中第377个天冬氨酸残基突变为半胱氨酸残基，经酶催化实验验证，D377C SHC可以将91.8%的鲨烯底物转化为单环化合物3-Deoxyachilleol A
在鉴定Bacillus megaterium来源的tetraprenyl-β-curcumene环化酶（BmeTC）活性的同时，开辟出了一条以鲨烯为底物、包含两步酶催化反应的龙涎香醇合成路径，如图1-3所示。定点突变酸热脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus acidocaldarius来源的鲨烯-藿烯环化酶（SHC）所得到的多个突变体中，D377C SHC是将SHC氨基酸残基序列中第377个天冬氨酸残基突变为半胱氨酸残基，经酶催化实验验证，D377C SHC可以将91.8%的鲨烯底物转化为单环化合物3-Deoxyachilleol A，并伴随着少量副产物藿烯和藿烷醇的生成[17]。3-Deoxyachilleol A六元环上的异亚甲基可能是由鲨烯分子中某个甲基的去质子化所形成的，D377C SHC酶催化反应体系的PH值为6.0，在此PH值条件下，D377C SHC酶促反应最适温度为60℃。起初，Sato等[18]验证了在B. megaterium菌株中筛选出的BmeTC具有环化C35萜烯的能力
本文编号：3388689
【文章来源】：天津大学天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
龙涎香醇的结构式Figure1-1Chemicalstructureof(+)-ambrein
50，其分子结构式如图1-2所示，最初从鲨鱼肝部中提取得到因而得名鲨烯。鲨烯是很多三萜化合物在生物合成途径中共同的前体物质，例如具有抗肿瘤活性的白桦脂酸等五环三萜化合物、原人参二醇等四环三萜化合物[15]。图 1-2 鲨烯的结构式Figure1-2 Chemical structure of squalene2013年，Ueda等[16]在鉴定Bacillus megaterium来源的tetraprenyl-β-curcumene环化酶（BmeTC）活性的同时，开辟出了一条以鲨烯为底物、包含两步酶催化反应的龙涎香醇合成路径，如图1-3所示。定点突变酸热脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus acidocaldarius来源的鲨烯-藿烯环化酶（SHC）所得到的多个突变体中，D377C SHC是将SHC氨基酸残基序列中第377个天冬氨酸残基突变为半胱氨酸残基，经酶催化实验验证，D377C SHC可以将91.8%的鲨烯底物转化为单环化合物3-Deoxyachilleol A
在鉴定Bacillus megaterium来源的tetraprenyl-β-curcumene环化酶（BmeTC）活性的同时，开辟出了一条以鲨烯为底物、包含两步酶催化反应的龙涎香醇合成路径，如图1-3所示。定点突变酸热脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus acidocaldarius来源的鲨烯-藿烯环化酶（SHC）所得到的多个突变体中，D377C SHC是将SHC氨基酸残基序列中第377个天冬氨酸残基突变为半胱氨酸残基，经酶催化实验验证，D377C SHC可以将91.8%的鲨烯底物转化为单环化合物3-Deoxyachilleol A，并伴随着少量副产物藿烯和藿烷醇的生成[17]。3-Deoxyachilleol A六元环上的异亚甲基可能是由鲨烯分子中某个甲基的去质子化所形成的，D377C SHC酶催化反应体系的PH值为6.0，在此PH值条件下，D377C SHC酶促反应最适温度为60℃。起初，Sato等[18]验证了在B. megaterium菌株中筛选出的BmeTC具有环化C35萜烯的能力
本文编号：3388689
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