脑膜炎奈瑟氏菌磷酸乙醇胺转移酶及其关键位点的鉴定及功能研究
发布时间：2021-09-07 12:05
类脂A是脂多糖的重要活性成分,其结构的变化将影响革兰氏阴性菌细胞外膜性质,从而导致细菌耐药性和毒力的变化。磷酸乙醇胺转移酶（EptA）是类脂A的结构修饰酶。磷酸乙醇胺基团的修饰使得类脂A上负电荷减少,从而中和了细菌表面的电负性。这一修饰使得多肽类抗生素与细菌外膜结合能力降低,则机体对革兰氏阴性菌的自身免疫降低。大肠杆菌为重要的模式菌株,构建大肠杆菌磷酸乙醇胺转移酶缺失菌株便于研究脑膜炎奈瑟氏菌和阪崎肠杆菌的磷酸乙醇胺转移酶。通过耐药性实验和细胞实验探索磷酸乙醇胺转移酶影响的细菌耐药性机制以及细菌的致病机理。本课题的主要研究结论如下:（1）通过比对Neisseria meningitidis MC58和E.coli BL21（DE3）磷酸乙醇胺转移酶EptA的同源性,在Neisseria meningitidis MC58中发现EptA编码基因NMBRS08540,并命名为NmeptA.构建E.coli BL21（DE3）ΔeptA突变菌株,E.coli BL21（DE3）ΔeptA/pET28a-NmEptA表达菌株,发现E.coli BL21（DE3）EptA和...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
大肠杆菌类脂A的合成途径及PEA修饰Fig.1-1TheconstitutivepathwayofE.colilipidAbiosynthesisandPEAmodification类脂的修饰
第一章绪论3灭细菌[20,21]。细菌进行类脂A正电基团的修饰，将会增强抵抗阳离子抗菌肽的能力。类脂A上的正电荷修饰也是革兰氏阴性菌获得性多肽类抗生素耐药性的主要原因。革兰氏阴性菌获得性多肽类抗生素耐药性是由特殊环境下PhoP/PhoQ二元调控系统释放PmrD，从而激活PmrAB调控系统，使得arn系列操纵子被激活，从而进行类脂A的正电修饰（图1-2）[15,22,23]。根据文献已知，弗朗西斯菌中的类脂A上1"和4"位上的磷酸基团分别能够被LpxE、LpxF磷酸酶选择性地去除。沙门氏菌中首先发现氨基阿拉伯糖转移酶（ArnT），类脂A上1"和4"位的磷酸基团能够在该酶的作用下加上氨基阿拉伯糖基团[24,25]。在弱酸性或在高镁离子等环境中，大肠杆菌以及阪崎肠杆菌中磷酸乙醇胺转移酶（EptA）表达，磷酸乙醇胺基团在该酶的作用下被特异性地加到在类脂A上1"和4"位上的磷酸上[26]。另外，与类脂A正负电荷修饰相关的酶还有LmtA、LpxT和EptB等[27]。类脂A分子形状的改变主要是依靠脂肪酸链数目和长度来改变。有文献指出，类脂A分子的形状可能与TLR4的识别有关。在沙门氏菌中，PagL和PagP分别将C3"位上的羟基脂肪酸链和C2"位上C16:0脂肪酸链去除[28]。大肠杆菌和阪崎肠杆菌中，类脂A在LpxM的作用下将增C12:0或者C14:0的酰基脂肪酸链。同时，在鼠疫杆菌类脂A中含6条脂肪酸链的菌体能够激活TLR4通路，而含4条脂肪酸链的菌体无法激活该通路。这也说明类脂A脂肪酸链的数目与其感染能力相关。图1-2革兰氏阴性菌获得性多肽类抗生素耐药性机制[23]Fig.1-2ThemechanismofGram-negativebacteriaacquiredpeptideantibioticresistance.1.2磷酸乙醇胺转移酶磷酸乙醇胺转移酶（EptA）是类脂A的正电修饰酶。EptA修饰类脂A上1"或者4"的磷酸基团，使得类脂A的负电荷减少，从而使得细?
?eptA基因进行同源性比对，结果得出NMB_RS08540与eptA的同源性在38.54%，且该基因是由1638bp核苷酸组成编码的氨基酸序列。NMB_RS10465与eptA的同源性在37.66%，由1578bp核苷酸组成编码的氨基酸。找到各自下游的两个基因，分别与E.coli中pmrA和pmrB基因进行比对，见图3-1。NMB_RS08540下游基因为NMB_RS08535和NMB_RS08530，与pmrA和pmrB同源性为37.26%和25.64%。而NMB_RS10465仅有下游基因NMB_RS10470，该基因与pmrA同源性为8.91%。从两个基因与E.coli中eptA基因DNA同源性和蛋白同源性来看，NMB_RS08540为eptA的同源基因。图3-1E.coli和NeisseriameningitidisMC58中磷酸乙醇胺修饰相关基因位置的比较Fig.3-1ThepositionofpEtNphosphotransferasesrelativegenesinE.coliandNeisseriameningitidisMC583.1.2E.coliBL21(DE3)ΔeptA构建和磷酸乙醇胺转移酶表达为验证NMB_RS08540基因功能，本研究对E.coliBL21(DE3)的eptA基因进行敲除，并将eptA进行回补表达，CseptA以及NMB_RS08540进行异源表达表达等改造，通过质谱进一步确定其功能。利用Jiang等的基因敲除方法[49]，在E.coliBL21(DE3)的染色体上进行eptA基因的
【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌类脂A的结构修饰及其应用前景[J]. 陈久洲,李烨,王小元. 微生物学通报. 2010(11)
[2]细菌类脂A结构与功能研究进展[J]. 李颜颜,史锋,李烨,王小元. 微生物学报. 2008(06)
硕士论文
[1]阪崎克罗诺肠杆菌类脂A磷酸乙醇胺转移酶相关基因的鉴定[D]. 刘璐.江南大学 2017
[2]合成不同结构类脂A分子的大肠杆菌的构建[D]. 韩雅宁.江南大学 2013
[3]大肠杆菌中类脂A分子结构的定向改造[D]. 陈久洲.江南大学 2010
本文编号：3389516
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
大肠杆菌类脂A的合成途径及PEA修饰Fig.1-1TheconstitutivepathwayofE.colilipidAbiosynthesisandPEAmodification类脂的修饰
第一章绪论3灭细菌[20,21]。细菌进行类脂A正电基团的修饰，将会增强抵抗阳离子抗菌肽的能力。类脂A上的正电荷修饰也是革兰氏阴性菌获得性多肽类抗生素耐药性的主要原因。革兰氏阴性菌获得性多肽类抗生素耐药性是由特殊环境下PhoP/PhoQ二元调控系统释放PmrD，从而激活PmrAB调控系统，使得arn系列操纵子被激活，从而进行类脂A的正电修饰（图1-2）[15,22,23]。根据文献已知，弗朗西斯菌中的类脂A上1"和4"位上的磷酸基团分别能够被LpxE、LpxF磷酸酶选择性地去除。沙门氏菌中首先发现氨基阿拉伯糖转移酶（ArnT），类脂A上1"和4"位的磷酸基团能够在该酶的作用下加上氨基阿拉伯糖基团[24,25]。在弱酸性或在高镁离子等环境中，大肠杆菌以及阪崎肠杆菌中磷酸乙醇胺转移酶（EptA）表达，磷酸乙醇胺基团在该酶的作用下被特异性地加到在类脂A上1"和4"位上的磷酸上[26]。另外，与类脂A正负电荷修饰相关的酶还有LmtA、LpxT和EptB等[27]。类脂A分子形状的改变主要是依靠脂肪酸链数目和长度来改变。有文献指出，类脂A分子的形状可能与TLR4的识别有关。在沙门氏菌中，PagL和PagP分别将C3"位上的羟基脂肪酸链和C2"位上C16:0脂肪酸链去除[28]。大肠杆菌和阪崎肠杆菌中，类脂A在LpxM的作用下将增C12:0或者C14:0的酰基脂肪酸链。同时，在鼠疫杆菌类脂A中含6条脂肪酸链的菌体能够激活TLR4通路，而含4条脂肪酸链的菌体无法激活该通路。这也说明类脂A脂肪酸链的数目与其感染能力相关。图1-2革兰氏阴性菌获得性多肽类抗生素耐药性机制[23]Fig.1-2ThemechanismofGram-negativebacteriaacquiredpeptideantibioticresistance.1.2磷酸乙醇胺转移酶磷酸乙醇胺转移酶（EptA）是类脂A的正电修饰酶。EptA修饰类脂A上1"或者4"的磷酸基团，使得类脂A的负电荷减少，从而使得细?
?eptA基因进行同源性比对，结果得出NMB_RS08540与eptA的同源性在38.54%，且该基因是由1638bp核苷酸组成编码的氨基酸序列。NMB_RS10465与eptA的同源性在37.66%，由1578bp核苷酸组成编码的氨基酸。找到各自下游的两个基因，分别与E.coli中pmrA和pmrB基因进行比对，见图3-1。NMB_RS08540下游基因为NMB_RS08535和NMB_RS08530，与pmrA和pmrB同源性为37.26%和25.64%。而NMB_RS10465仅有下游基因NMB_RS10470，该基因与pmrA同源性为8.91%。从两个基因与E.coli中eptA基因DNA同源性和蛋白同源性来看，NMB_RS08540为eptA的同源基因。图3-1E.coli和NeisseriameningitidisMC58中磷酸乙醇胺修饰相关基因位置的比较Fig.3-1ThepositionofpEtNphosphotransferasesrelativegenesinE.coliandNeisseriameningitidisMC583.1.2E.coliBL21(DE3)ΔeptA构建和磷酸乙醇胺转移酶表达为验证NMB_RS08540基因功能，本研究对E.coliBL21(DE3)的eptA基因进行敲除，并将eptA进行回补表达，CseptA以及NMB_RS08540进行异源表达表达等改造，通过质谱进一步确定其功能。利用Jiang等的基因敲除方法[49]，在E.coliBL21(DE3)的染色体上进行eptA基因的
【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌类脂A的结构修饰及其应用前景[J]. 陈久洲,李烨,王小元. 微生物学通报. 2010(11)
[2]细菌类脂A结构与功能研究进展[J]. 李颜颜,史锋,李烨,王小元. 微生物学报. 2008(06)
硕士论文
[1]阪崎克罗诺肠杆菌类脂A磷酸乙醇胺转移酶相关基因的鉴定[D]. 刘璐.江南大学 2017
[2]合成不同结构类脂A分子的大肠杆菌的构建[D]. 韩雅宁.江南大学 2013
[3]大肠杆菌中类脂A分子结构的定向改造[D]. 陈久洲.江南大学 2010
本文编号：3389516
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