高活力海藻糖酶基因的挖掘及其在黑曲霉中的高效表达研究
发布时间：2021-09-19 17:09
海藻糖酶（EC3.2.1.28）是一种葡萄糖苷水解酶,可以催化一分子海藻糖水解生成两分子葡萄糖。在乙醇和谷氨酸发酵过程中,添加海藻糖酶可以提高发酵结束时乙醇和谷氨酸的产量,降低发酵液中的残糖含量,从而降低生产成本,具有较大的经济效益。同时,海藻糖酶还作为海藻糖不耐受病人的一种潜在治疗用酶和食品添加剂,但是目前报道的海藻糖酶重组表达水平普遍较低,尚没有海藻糖酶高产菌株的报道。本文以无孢黑曲霉HL-1为蛋白表达宿主,从六种丝状真菌中挖掘九个不同的海藻糖酶基因,并在黑曲霉中进行表达筛选,得到两个高活力海藻糖酶基因,通过利用CRISPR/Cas9技术、培养基优化、过表达AmyR（An04g06910）、Cog（An16g03450）、Sed（An16g03450）以及突变Ire A（An01g06550）的方法,构建出两株高活力海藻糖酶高产菌株,发酵液经凝胶过滤层析纯化后,研究其酶学性质并将应用于酵母乙醇发酵,主要研究内容如下:（1）构建黑曲霉蛋白表达通用载体,将启动子Pna II/TPI片段、不同海藻糖酶基因分别与线性化的通用表达载体连接,构建出9个不同海藻糖酶表达载体,转化宿主黑曲霉HL-...
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：136 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
α-α-海藻糖结构式
导致慢性疾病的能力。在分枝杆菌和棒状杆菌中，海藻糖还是许多细胞壁糖脂的结构成分，例如在结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)中，既提供药物的不渗透性，又提供免除吞噬细胞杀伤保护作用的细胞壁“结合因子”的主要成分是海藻糖6,6-二甲酸酯[7]。1.2海藻糖酶1.2.1海藻糖酶的分类海藻糖酶(Trehalase)是一种葡萄糖苷水解酶，在酶分类上归属于水解酶，分类编号为EC3.2.1.28，可以特异性催化一分子的海藻糖水解生成两分子的葡萄糖，广泛分布于包括细菌、霉菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物在内的生物体中[9]。图1-2海藻糖酶水解作用Fig1-2Structuralformulaoftrehaloseandprincipleoftrehalasehydrolysis海藻糖酶最早由Bourquelot于1893年在黑曲霉中发现，1895年Fischer在酿酒酵母里也发现了海藻糖酶，后来科研人员在不同的生物里不断地发现和鉴定了不同的海藻糖酶[10]。根据已知的和预测的蛋白氨基酸序列，在Carbohydrate-ActiveEnZymes(CAZy)数据库中，海藻糖酶被分在糖苷水解酶第15、37、65家族(GH15、GH37、GH6)三个类
华南理工大学硕士学位论文8图1-3丝状真菌胞外蛋白表达和分泌途径[34]Fig1-3Extracellularproteinexpressionandsecretioninfilamentousfungal随着研究的深入，以上三个阶段的具体机制和影响因素逐渐被探索出来，而这些影响因素正是提高丝状真菌蛋白表达水平的改造对象。转录即是蛋白的DNA序列在RNA聚合酶的作用下合成互补的mRNA序列，这个阶段的主要影响因素包括启动子的强弱、转录因子的激活、蛋白基因的拷贝数、蛋白基因在基因组的位置等。翻译和加工是以蛋白mRNA序列为模板，在核糖体中翻译成氨基酸多肽链，运输到内质网进行折叠和初步加工，再运输到高尔基体中进一步加工修饰成熟，这一阶段是目前提高丝状真菌蛋白表达水平的主要改造对象，其主要影响因素包括宿主的密码子偏好性、信号肽识别、非折叠蛋白压力响应(UnfoldedProteinResponse,UPR)、内质网相关蛋白降解途径(ER-AssociatedproteinDegradation,ERAD)、自体吞噬(Autophagy，AP)、内质网和高尔基体之间的囊泡运输过程，其中UPR、ERAD和AP是丝状真菌蛋白合成过程质量控制的关键步骤。分泌是将高尔基体中加工成熟的蛋白通过囊泡运输到达细胞质膜，最后分泌到细胞外，这个阶段的主要影响因素是高尔基体和细胞质膜之间的囊泡运输。1.4.1转录阶段的改造策略1、使用强启动子在黑曲霉(A.niger)中常使用的诱导型强启动子包括黑曲霉糖化酶启动子PglaA[35,36]、黑曲霉中性淀粉酶启动子PamyA[37]，米曲霉(A.oryzae)中常用的诱导型启动子为α-淀粉酶启动子Pamy[38]，这三个启动子都是糖代谢型启动子，在麦芽糖或者淀粉存在时，可以诱导蛋白基因的大量转录。此外，Ishida等[39]从米曲霉中筛选出一个新的强诱导型启动子PsodM（超氧化物酶启动子），用于表达葡萄糖淀粉酶。目前为止，
【参考文献】：
期刊论文
[1]海藻糖酶在谷氨酸发酵过程中的应用[J]. 王兰刚,韩隽,李进,宋小东,王志平,张明. 发酵科技通讯. 2019(03)
[2]18S rDNA介导的桔青霉核酸酶P1表达载体的构建及表达分析[J]. 陈筱仪,王斌,潘力. 现代食品科技. 2019(06)
[3]Escherichia coli str.K-12 substr.MG1655海藻糖酶Tre F的重组表达及性质研究[J]. 于林港,宿玲恰,吴敬. 生物技术通报. 2017(04)
[4]海藻糖酶在谷氨酸发酵中的应用[J]. 韩隽,姬慧军. 广州化工. 2017(07)
[5]CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在动物基因组定点修饰中的应用[J]. 周金伟,徐绮嫔,姚婧,余树民,曹随忠. 遗传. 2015(10)
[6]CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J]. 李聪,曹文广. 生物工程学报. 2015(11)
[7]CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展[J]. 刘志国. 畜牧兽医学报. 2014(10)
[8]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[9]黑曲霉作为细胞工厂:知识准备与技术基础[J]. 郭艳梅,郑平,孙际宾. 生物工程学报. 2010(10)
[10]海藻糖酶的酶学特性及其作为新农药靶标的开发应用[J]. 范柯琴,金利群,郑裕国. 化学与生物工程. 2009(04)
硕士论文
[1]南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及硅藻土固定化应用研究[D]. 张玲敏.华南理工大学 2019
[2]鲁氏酵母胞内高海藻糖发酵调控及代谢特征研究[D]. 刘翠翠.湖北工业大学 2018
[3]黑曲霉基因组中单宁酶基因的挖掘筛选及蛋白表达研究[D]. 刘凤玲.华南理工大学 2018
本文编号：3402008
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：136 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
α-α-海藻糖结构式
导致慢性疾病的能力。在分枝杆菌和棒状杆菌中，海藻糖还是许多细胞壁糖脂的结构成分，例如在结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)中，既提供药物的不渗透性，又提供免除吞噬细胞杀伤保护作用的细胞壁“结合因子”的主要成分是海藻糖6,6-二甲酸酯[7]。1.2海藻糖酶1.2.1海藻糖酶的分类海藻糖酶(Trehalase)是一种葡萄糖苷水解酶，在酶分类上归属于水解酶，分类编号为EC3.2.1.28，可以特异性催化一分子的海藻糖水解生成两分子的葡萄糖，广泛分布于包括细菌、霉菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物在内的生物体中[9]。图1-2海藻糖酶水解作用Fig1-2Structuralformulaoftrehaloseandprincipleoftrehalasehydrolysis海藻糖酶最早由Bourquelot于1893年在黑曲霉中发现，1895年Fischer在酿酒酵母里也发现了海藻糖酶，后来科研人员在不同的生物里不断地发现和鉴定了不同的海藻糖酶[10]。根据已知的和预测的蛋白氨基酸序列，在Carbohydrate-ActiveEnZymes(CAZy)数据库中，海藻糖酶被分在糖苷水解酶第15、37、65家族(GH15、GH37、GH6)三个类
华南理工大学硕士学位论文8图1-3丝状真菌胞外蛋白表达和分泌途径[34]Fig1-3Extracellularproteinexpressionandsecretioninfilamentousfungal随着研究的深入，以上三个阶段的具体机制和影响因素逐渐被探索出来，而这些影响因素正是提高丝状真菌蛋白表达水平的改造对象。转录即是蛋白的DNA序列在RNA聚合酶的作用下合成互补的mRNA序列，这个阶段的主要影响因素包括启动子的强弱、转录因子的激活、蛋白基因的拷贝数、蛋白基因在基因组的位置等。翻译和加工是以蛋白mRNA序列为模板，在核糖体中翻译成氨基酸多肽链，运输到内质网进行折叠和初步加工，再运输到高尔基体中进一步加工修饰成熟，这一阶段是目前提高丝状真菌蛋白表达水平的主要改造对象，其主要影响因素包括宿主的密码子偏好性、信号肽识别、非折叠蛋白压力响应(UnfoldedProteinResponse,UPR)、内质网相关蛋白降解途径(ER-AssociatedproteinDegradation,ERAD)、自体吞噬(Autophagy，AP)、内质网和高尔基体之间的囊泡运输过程，其中UPR、ERAD和AP是丝状真菌蛋白合成过程质量控制的关键步骤。分泌是将高尔基体中加工成熟的蛋白通过囊泡运输到达细胞质膜，最后分泌到细胞外，这个阶段的主要影响因素是高尔基体和细胞质膜之间的囊泡运输。1.4.1转录阶段的改造策略1、使用强启动子在黑曲霉(A.niger)中常使用的诱导型强启动子包括黑曲霉糖化酶启动子PglaA[35,36]、黑曲霉中性淀粉酶启动子PamyA[37]，米曲霉(A.oryzae)中常用的诱导型启动子为α-淀粉酶启动子Pamy[38]，这三个启动子都是糖代谢型启动子，在麦芽糖或者淀粉存在时，可以诱导蛋白基因的大量转录。此外，Ishida等[39]从米曲霉中筛选出一个新的强诱导型启动子PsodM（超氧化物酶启动子），用于表达葡萄糖淀粉酶。目前为止，
【参考文献】：
期刊论文
[1]海藻糖酶在谷氨酸发酵过程中的应用[J]. 王兰刚,韩隽,李进,宋小东,王志平,张明. 发酵科技通讯. 2019(03)
[2]18S rDNA介导的桔青霉核酸酶P1表达载体的构建及表达分析[J]. 陈筱仪,王斌,潘力. 现代食品科技. 2019(06)
[3]Escherichia coli str.K-12 substr.MG1655海藻糖酶Tre F的重组表达及性质研究[J]. 于林港,宿玲恰,吴敬. 生物技术通报. 2017(04)
[4]海藻糖酶在谷氨酸发酵中的应用[J]. 韩隽,姬慧军. 广州化工. 2017(07)
[5]CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在动物基因组定点修饰中的应用[J]. 周金伟,徐绮嫔,姚婧,余树民,曹随忠. 遗传. 2015(10)
[6]CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J]. 李聪,曹文广. 生物工程学报. 2015(11)
[7]CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展[J]. 刘志国. 畜牧兽医学报. 2014(10)
[8]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[9]黑曲霉作为细胞工厂:知识准备与技术基础[J]. 郭艳梅,郑平,孙际宾. 生物工程学报. 2010(10)
[10]海藻糖酶的酶学特性及其作为新农药靶标的开发应用[J]. 范柯琴,金利群,郑裕国. 化学与生物工程. 2009(04)
硕士论文
[1]南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及硅藻土固定化应用研究[D]. 张玲敏.华南理工大学 2019
[2]鲁氏酵母胞内高海藻糖发酵调控及代谢特征研究[D]. 刘翠翠.湖北工业大学 2018
[3]黑曲霉基因组中单宁酶基因的挖掘筛选及蛋白表达研究[D]. 刘凤玲.华南理工大学 2018
本文编号：3402008
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