利用酿酒酵母构建OGT活性检测及新底物筛选体系
发布时间：2021-10-31 08:48
蛋白质的O-连接N-乙酰氨基葡萄糖（O-linked N-Acetylglucosamine,O-GlcNAc）修饰是蛋白翻译后修饰的一种,在该修饰过程中单一的GlcNAc以β构型的方式连接于蛋白质的丝氨酸/苏氨酸的侧链羟基上。在真核细胞中,O-GlcNAc修饰过程是由O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc Transferase,OGT）和O-GlcNAc水解酶（O-GlcNAcase,OGA）共同催化完成的动态修饰过程。O-GlcNAc修饰循环过程在绝大多数真核细胞中是保守的,酿酒酵母细胞中缺乏蛋白质O-GlcNAc修饰的酶。本论文在酿酒酵母细胞中表达OGT的不同亚型,构建了OGT各亚型独立的研究体系;此外,鉴定了表达sOGT的酿酒酵母中O-GlcNAc修饰的内源蛋白,并对新发现的O-GlcNAc修饰蛋白进行了验证。论文详细研究结果如下:（1）OGT三个蛋白亚型的主要差别是N端氨基酸序列的不同,我们的研究发现外源表达不同的OGT亚型对酿酒酵母生长抑制作用具有差异性,这些差异与OGT的N端氨基酸序列的不同组成密切相关;短OGT（short OGT,sOGT）对酿酒酵母的抑制作用依赖...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：109 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
脊椎动物中主要的糖基化修饰[4]
第一章绪论3质及线粒体中，这与传统的糖基化修饰蛋白分布于细胞表面或膜结构腔内（内质网或者高尔基体内）存在着显著的差别[10]。虽然此后依然有关于碳水化合物对蛋白质的修饰的报道，但O-GlcNAc修饰依然是胞内存在最广泛的单糖修饰。胞内蛋白质的O-GlcNAc修饰水平受供体底物尿嘧啶二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc）的浓度、蛋白质在胞内的定位及细胞分化状态等方面的影响。哺乳动物细胞中UDP-GlcNAc的合成以葡萄糖为底物，经过氨基酸、脂肪酸和核酸的氨基己糖代谢途径（hexosaminebiosyntheticpathway，HBP）生成（如图1-2所示）。大约2-5%的胞内葡萄糖会流向HBP途径产生UDP-GlcNAc[11]。图1-2O-GlcNAc修饰的底物UDP-GlcNAc的合成途径[11]Figure1-2UDP-GlcNAcsynthesis[11]在细胞内O-GlcNAc修饰的蛋白主要存于核孔蛋白和细胞骨架蛋白中，N-乙酰氨基葡萄糖的添加过程由O-GlcNAc转移酶（OGT;uridinediphospho-N-acetylgl-ucosamine:polypeptideβ-N-acetylglucosaminyltransferase;EC2.4.1.255）催化完成，与其它的翻译后修饰不同的是OGT作为单一蛋白催化整个细胞中所有底物的蛋白质O-GlcNAc修饰。O-GlcNAc的水解过程同样是由单一蛋白催化的，即为乙酰氨基葡萄糖水解酶（O-GlcNAcase;OGA;EC3.2.1.169）。在真核细胞内，OGT和OGA催化的反应过程在胞内是同时进行的（如图1-3所示），因此，蛋白质的O-GlcNAc修饰是一个动态平衡的过程[12]。
江南大学博士学位论文4图1-3蛋白质的O-GlcNAc修饰示意图Figure1-3schematicofproteinO-GlcNAcmodificationO-GlcNAc修饰广泛存在于后生动物中，除了哺乳动物和植物以外，原生动物、原核生物李斯特菌[13]，丝状真菌中蛋白质的O-GlcNAc修饰同样存在[14]。在细胞核中能检测到的O-GlcNAc修饰信号最强，含量最高的当属核孔蛋白和染色质结合的蛋白[9,15-17]。同时，在细胞质[15]、线粒体[18]及一些膜蛋白[15]中也发现了O-GlcNAc修饰的存在。1.2.2蛋白质的O-GlcNAc修饰的重要性同大多数蛋白质翻译后修饰一样，O-GlcNAc糖基化修饰影响着蛋白功能的发挥、蛋白质之间的相互作用、蛋白的稳定性、蛋白的定位及酶的活性[19-21]。正常的蛋白质O-GlcNAc修饰通过以下几个方面来发挥其重要作用：（1）调控蛋白质的磷酸化；（2）调控蛋白质的降解；（3）影响蛋白质的定位；（4）调节蛋白-蛋白间的相互作用；（5）调整胞内的蛋白转录水平。从蛋白质O-GlcNAc修饰水平上来看，修饰水平过高或缺失都会导致胞内代谢调控的紊乱。研究表明，在斑马鱼中降低或增加OGT的表达水平会导致形态改变、损害胚胎细胞的生长及降低细胞的存活率[22]。在小鼠模型中OGT的缺失会导致小鼠胚胎期死亡[23,24]；OGA的敲除会影响到小鼠细胞的分裂、胚胎细胞的生长及出生早期死亡或发育迟缓[25]。而且，在人类癌症细胞中OGT的表达水平和蛋白质的O-GlcNAc修饰水平都较正常细胞高[26-28]。除了在胚胎早期蛋白质的O-GlcNAc修饰发挥着重要的作用，O-GlcNAc修饰过程同样调控着成年细胞的葡萄糖动态平衡和代谢。蛋白质的O-GlcNAc修饰水平会跟随着细胞的营养状态发生改变，在进食或者糖尿病人的肝脏中蛋白质的修饰水平会增加。细胞的关键转录因子和辅因子的O-GlcNAc糖基化修饰会调控葡萄糖的代谢，例
【参考文献】：
期刊论文
[1]在酿酒酵母中研究人类mOGT基质导向序列的功能[J]. 李凤,高晓冬,中西秀树. 中国生物工程杂志. 2019(04)
[2]鲍曼不动杆菌Omp34经线粒体途径诱导HeLa细胞凋亡[J]. 安志远,丁文一. 生物技术. 2018(04)
[3]人体线粒体N-乙酰氨基葡萄糖转移酶在酿酒酵母中的表达[J]. 韩宝仙,高晓冬,中西秀树. 食品与生物技术学报. 2016(09)
硕士论文
[1]基于酿酒酵母的人源N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（OGT）的分析[D]. 韩宝仙.江南大学 2015
本文编号：3467826
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：109 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
脊椎动物中主要的糖基化修饰[4]
第一章绪论3质及线粒体中，这与传统的糖基化修饰蛋白分布于细胞表面或膜结构腔内（内质网或者高尔基体内）存在着显著的差别[10]。虽然此后依然有关于碳水化合物对蛋白质的修饰的报道，但O-GlcNAc修饰依然是胞内存在最广泛的单糖修饰。胞内蛋白质的O-GlcNAc修饰水平受供体底物尿嘧啶二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc）的浓度、蛋白质在胞内的定位及细胞分化状态等方面的影响。哺乳动物细胞中UDP-GlcNAc的合成以葡萄糖为底物，经过氨基酸、脂肪酸和核酸的氨基己糖代谢途径（hexosaminebiosyntheticpathway，HBP）生成（如图1-2所示）。大约2-5%的胞内葡萄糖会流向HBP途径产生UDP-GlcNAc[11]。图1-2O-GlcNAc修饰的底物UDP-GlcNAc的合成途径[11]Figure1-2UDP-GlcNAcsynthesis[11]在细胞内O-GlcNAc修饰的蛋白主要存于核孔蛋白和细胞骨架蛋白中，N-乙酰氨基葡萄糖的添加过程由O-GlcNAc转移酶（OGT;uridinediphospho-N-acetylgl-ucosamine:polypeptideβ-N-acetylglucosaminyltransferase;EC2.4.1.255）催化完成，与其它的翻译后修饰不同的是OGT作为单一蛋白催化整个细胞中所有底物的蛋白质O-GlcNAc修饰。O-GlcNAc的水解过程同样是由单一蛋白催化的，即为乙酰氨基葡萄糖水解酶（O-GlcNAcase;OGA;EC3.2.1.169）。在真核细胞内，OGT和OGA催化的反应过程在胞内是同时进行的（如图1-3所示），因此，蛋白质的O-GlcNAc修饰是一个动态平衡的过程[12]。
江南大学博士学位论文4图1-3蛋白质的O-GlcNAc修饰示意图Figure1-3schematicofproteinO-GlcNAcmodificationO-GlcNAc修饰广泛存在于后生动物中，除了哺乳动物和植物以外，原生动物、原核生物李斯特菌[13]，丝状真菌中蛋白质的O-GlcNAc修饰同样存在[14]。在细胞核中能检测到的O-GlcNAc修饰信号最强，含量最高的当属核孔蛋白和染色质结合的蛋白[9,15-17]。同时，在细胞质[15]、线粒体[18]及一些膜蛋白[15]中也发现了O-GlcNAc修饰的存在。1.2.2蛋白质的O-GlcNAc修饰的重要性同大多数蛋白质翻译后修饰一样，O-GlcNAc糖基化修饰影响着蛋白功能的发挥、蛋白质之间的相互作用、蛋白的稳定性、蛋白的定位及酶的活性[19-21]。正常的蛋白质O-GlcNAc修饰通过以下几个方面来发挥其重要作用：（1）调控蛋白质的磷酸化；（2）调控蛋白质的降解；（3）影响蛋白质的定位；（4）调节蛋白-蛋白间的相互作用；（5）调整胞内的蛋白转录水平。从蛋白质O-GlcNAc修饰水平上来看，修饰水平过高或缺失都会导致胞内代谢调控的紊乱。研究表明，在斑马鱼中降低或增加OGT的表达水平会导致形态改变、损害胚胎细胞的生长及降低细胞的存活率[22]。在小鼠模型中OGT的缺失会导致小鼠胚胎期死亡[23,24]；OGA的敲除会影响到小鼠细胞的分裂、胚胎细胞的生长及出生早期死亡或发育迟缓[25]。而且，在人类癌症细胞中OGT的表达水平和蛋白质的O-GlcNAc修饰水平都较正常细胞高[26-28]。除了在胚胎早期蛋白质的O-GlcNAc修饰发挥着重要的作用，O-GlcNAc修饰过程同样调控着成年细胞的葡萄糖动态平衡和代谢。蛋白质的O-GlcNAc修饰水平会跟随着细胞的营养状态发生改变，在进食或者糖尿病人的肝脏中蛋白质的修饰水平会增加。细胞的关键转录因子和辅因子的O-GlcNAc糖基化修饰会调控葡萄糖的代谢，例
【参考文献】：
期刊论文
[1]在酿酒酵母中研究人类mOGT基质导向序列的功能[J]. 李凤,高晓冬,中西秀树. 中国生物工程杂志. 2019(04)
[2]鲍曼不动杆菌Omp34经线粒体途径诱导HeLa细胞凋亡[J]. 安志远,丁文一. 生物技术. 2018(04)
[3]人体线粒体N-乙酰氨基葡萄糖转移酶在酿酒酵母中的表达[J]. 韩宝仙,高晓冬,中西秀树. 食品与生物技术学报. 2016(09)
硕士论文
[1]基于酿酒酵母的人源N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（OGT）的分析[D]. 韩宝仙.江南大学 2015
本文编号：3467826
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