基于核糖体工程技术的ε-聚赖氨酸高产菌株选育及高产机制解析
发布时间：2021-11-04 07:01
ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine,ε-PL）是由25-35个L-赖氨酸单体通过α-羧基和ε-氨基脱水缩合而成的同型L-赖氨酸链状聚合物。由于其具有pH使用范围宽、热稳定好、抑菌性广、水溶性强以及安全性能高等优点,目前主要作为防腐剂应用在食品防腐和保鲜领域,已经在日本、韩国、美国和中国等国家广泛使用。同时,作为一种新型阳离子生物聚合物,ε-PL还广泛应用于药物载体和生物材料研究。因此,选育ε-PL高产菌株及探究其高产机制,实现低成本、高效率ε-PL发酵生产,为ε-PL的产业化提供技术支撑至关重要。论文以S.albulus M-Z18为出发菌株,首先建立了针对S.albulus培养和ε-PL检测的高通量平台技术;然后,建立了多次抗生素抗性引入的核糖体工程育种技术,并结合基因组重排育种技术,大幅度提高了S.albulus的ε-PL合成能力;随后,借助生理生化分析手段,系统分析了突变株较出发菌株在生理水平上发生的变化;同时,借助比较蛋白质组学技术,系统分析了突变株较出发菌株在蛋白水平上发生的变化,在此基础上通过代谢工...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：120 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
ε-PL合成酶的结构
江南大学博士学位论文8图1-4核糖体工程激活细胞功能示意图[36]Fig.1-4Schemeofribosomeengineeringtoactivatecellularfunction1.2.5.3核糖体工程的应用链霉菌、芽孢杆菌、假单胞菌属等在工业、农业、环保等方面具有重要的应用价值。近年来，人们利用核糖体工程技术的相关理论，在链霉菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属等性状的改良方面获得了理想的成果。1996年，Shima等[76]发现变铅青链霉菌TK24突变体（K88E突变）可以激活放线紫红素的产生，而野生菌本身是不产放线紫红素的。1997年，Hesketh和Ochi[77]将此类突变引入天蓝色链霉菌A3（2）中，放线紫红素的产量也提高。后来，KozoOchi团队不断在链霉菌属中引入抗生素双重突变、三重突变乃至八重突变，使得次级代谢产物的合成能力不断提高[37,38]。其他的研究学者也利用核糖体工程来提高氯霉素、纺锤菌素、沙利霉素、诺西肽等抗生素的产量[37,78,79]。此外，向微生物细胞中引入抗药性突变，还可提高芽孢杆菌α-淀粉酶及蛋白酶的产量[80]。Hosokawa等[81]发现恶臭假单孢菌的Str、Gen和Rif突变株对4-对羟基苯甲酸、甲苯等有机溶剂的耐受性提高。2004年，Inaoka等[82]通过引入Rif抗性的rpoB突变，激活了枯草芽孢杆菌中的沉默基因ntdABC，大大提高了3,3-neotrehalosadiamine（NTD）的产量。野生的枯草芽胞杆菌通常不能或者只能合成少量的NTD。Hosaka等[83]将核糖体工程应用到基于大肠杆菌的无细胞翻译系统中，发现核糖体蛋白S12突变体K42T（S12蛋白的第42个氨基酸Lys被Thr替代）蛋白合成能力是野生型核糖体的1.3-2倍左右，核糖体工程技术在提高无细胞翻译系统的蛋白合成效率方面也是一种非常有效的方法。
江南大学博士学位论文10（1）建立了针对S.albulus培养和ε-PL检测的高通量平台技术。利用微孔板培养方法，建立了24/48孔板发酵产ε-PL体系；并建立了与之相匹配的微量、快速检测ε-PL方法。（2）建立了多次抗生素抗性引入的核糖体工程育种技术，并结合基因组重排育种技术、“基因组重排+核糖体工程”的育种策略大幅度提高了S.albulus的ε-PL合成能力。（3）比较出发菌株和ε-PL高产菌株在发酵性能、基因突变位点、代谢流分布、ATP合成和关键酶活性等的差异，借助生理生化分析手段，系统分析了突变株较出发菌株在生理水平上发生的变化。（4）借助比较蛋白质组学技术，系统分析了突变株较出发菌株在蛋白水平上发生的变化，并通过过量表达关键蛋白验证差异蛋白对ε-PL合成的影响。（5）对出发菌株与ε-PL高产菌株进行全基因组测序，借助比较基因组学技术，深入分析了突变株较出发菌株在基因组水平上发生的变化。图1-5本论文的主要框架Fig.1-5Theoutlineofthisstudy
【参考文献】：
期刊论文
[1]ε-聚赖氨酸高产菌选育与发酵性能评价[J]. 郑根成,王靓,高阳,向金鑫,陈旭升,毛忠贵. 微生物学报. 2016(09)
[2]质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J]. 甄艳,施季森. 南京林业大学学报(自然科学版). 2011(01)
[3]微生物诱变育种方法研究进展[J]. 李荣杰. 河北农业科学. 2009(10)
[4]微生物核糖体工程研究进展[J]. 谢庶洁,肖静,徐俊. 微生物学报. 2009(08)
[5]高产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的复合诱变选育研究[J]. 余明洁,田丰伟,范大明,赵建新,陈卫,张灏. 食品工业科技. 2008(07)
[6]全基因组重排育种技术提高豆豉纤溶酶菌产酶量[J]. 梁惠仪,郭勇. 中国生物工程杂志. 2007(10)
[7]紫外诱变选育多聚赖氨酸高产菌株的研究[J]. 杨玉红,于雪骊,刘长江. 北方园艺. 2007(09)
[8]大剂量紫外诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌[J]. 张超,王正刚,段作营,毛忠贵. 生物加工过程. 2007(03)
[9]ε-聚赖氨酸高产菌株选育及分批发酵的研究[J]. 陈玮玮,朱宏阳,徐虹. 工业微生物. 2007(02)
[10]氮离子注入选育阿维拉霉素高产菌株的研究[J]. 贺亚男,朱传合,杜连祥,路福平. 微生物学通报. 2007(01)
博士论文
[1]ε-聚赖氨酸产生菌的育种、发酵及高产机制的初步生理解析[D]. 王靓.江南大学 2018
[2]高通量筛选及基因组重排选育维吉尼亚霉素高产菌[D]. 仝倩倩.中国科学技术大学 2018
[3]小白链霉菌同步代谢葡萄糖和甘油合成ε-聚赖氨酸的生理机制研究[D]. 曾昕.江南大学 2016
[4]小白链霉菌响应酸性pH高产ε-聚赖氨酸的生理解析[D]. 任喜东.江南大学 2015
[5]产酸丙酸杆菌耐酸机制解析及代谢调控研究[D]. 管宁子.江南大学 2015
硕士论文
[1]基于细菌全基因组技术对AMDY2-9-2的氧化硫能力研究[D]. 闵婕.南京大学 2019
[2]小白链霉菌响应低pH胁迫生理机制的初步解析[D]. 王开方.江南大学 2019
[3]核糖体工程选育ε-聚赖氨酸高产菌及发酵pH调控策略优化[D]. 吴光耀.江南大学 2016
[4]Genome shuffling技术选育ε-聚赖氨酸高产菌[D]. 李凤.江南大学 2012
[5]ε-聚赖氨酸高产菌株选育与发酵过程优化[D]. 陈旭升.江南大学 2008
本文编号：3475236
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：120 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
ε-PL合成酶的结构
江南大学博士学位论文8图1-4核糖体工程激活细胞功能示意图[36]Fig.1-4Schemeofribosomeengineeringtoactivatecellularfunction1.2.5.3核糖体工程的应用链霉菌、芽孢杆菌、假单胞菌属等在工业、农业、环保等方面具有重要的应用价值。近年来，人们利用核糖体工程技术的相关理论，在链霉菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属等性状的改良方面获得了理想的成果。1996年，Shima等[76]发现变铅青链霉菌TK24突变体（K88E突变）可以激活放线紫红素的产生，而野生菌本身是不产放线紫红素的。1997年，Hesketh和Ochi[77]将此类突变引入天蓝色链霉菌A3（2）中，放线紫红素的产量也提高。后来，KozoOchi团队不断在链霉菌属中引入抗生素双重突变、三重突变乃至八重突变，使得次级代谢产物的合成能力不断提高[37,38]。其他的研究学者也利用核糖体工程来提高氯霉素、纺锤菌素、沙利霉素、诺西肽等抗生素的产量[37,78,79]。此外，向微生物细胞中引入抗药性突变，还可提高芽孢杆菌α-淀粉酶及蛋白酶的产量[80]。Hosokawa等[81]发现恶臭假单孢菌的Str、Gen和Rif突变株对4-对羟基苯甲酸、甲苯等有机溶剂的耐受性提高。2004年，Inaoka等[82]通过引入Rif抗性的rpoB突变，激活了枯草芽孢杆菌中的沉默基因ntdABC，大大提高了3,3-neotrehalosadiamine（NTD）的产量。野生的枯草芽胞杆菌通常不能或者只能合成少量的NTD。Hosaka等[83]将核糖体工程应用到基于大肠杆菌的无细胞翻译系统中，发现核糖体蛋白S12突变体K42T（S12蛋白的第42个氨基酸Lys被Thr替代）蛋白合成能力是野生型核糖体的1.3-2倍左右，核糖体工程技术在提高无细胞翻译系统的蛋白合成效率方面也是一种非常有效的方法。
江南大学博士学位论文10（1）建立了针对S.albulus培养和ε-PL检测的高通量平台技术。利用微孔板培养方法，建立了24/48孔板发酵产ε-PL体系；并建立了与之相匹配的微量、快速检测ε-PL方法。（2）建立了多次抗生素抗性引入的核糖体工程育种技术，并结合基因组重排育种技术、“基因组重排+核糖体工程”的育种策略大幅度提高了S.albulus的ε-PL合成能力。（3）比较出发菌株和ε-PL高产菌株在发酵性能、基因突变位点、代谢流分布、ATP合成和关键酶活性等的差异，借助生理生化分析手段，系统分析了突变株较出发菌株在生理水平上发生的变化。（4）借助比较蛋白质组学技术，系统分析了突变株较出发菌株在蛋白水平上发生的变化，并通过过量表达关键蛋白验证差异蛋白对ε-PL合成的影响。（5）对出发菌株与ε-PL高产菌株进行全基因组测序，借助比较基因组学技术，深入分析了突变株较出发菌株在基因组水平上发生的变化。图1-5本论文的主要框架Fig.1-5Theoutlineofthisstudy
【参考文献】：
期刊论文
[1]ε-聚赖氨酸高产菌选育与发酵性能评价[J]. 郑根成,王靓,高阳,向金鑫,陈旭升,毛忠贵. 微生物学报. 2016(09)
[2]质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J]. 甄艳,施季森. 南京林业大学学报(自然科学版). 2011(01)
[3]微生物诱变育种方法研究进展[J]. 李荣杰. 河北农业科学. 2009(10)
[4]微生物核糖体工程研究进展[J]. 谢庶洁,肖静,徐俊. 微生物学报. 2009(08)
[5]高产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的复合诱变选育研究[J]. 余明洁,田丰伟,范大明,赵建新,陈卫,张灏. 食品工业科技. 2008(07)
[6]全基因组重排育种技术提高豆豉纤溶酶菌产酶量[J]. 梁惠仪,郭勇. 中国生物工程杂志. 2007(10)
[7]紫外诱变选育多聚赖氨酸高产菌株的研究[J]. 杨玉红,于雪骊,刘长江. 北方园艺. 2007(09)
[8]大剂量紫外诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌[J]. 张超,王正刚,段作营,毛忠贵. 生物加工过程. 2007(03)
[9]ε-聚赖氨酸高产菌株选育及分批发酵的研究[J]. 陈玮玮,朱宏阳,徐虹. 工业微生物. 2007(02)
[10]氮离子注入选育阿维拉霉素高产菌株的研究[J]. 贺亚男,朱传合,杜连祥,路福平. 微生物学通报. 2007(01)
博士论文
[1]ε-聚赖氨酸产生菌的育种、发酵及高产机制的初步生理解析[D]. 王靓.江南大学 2018
[2]高通量筛选及基因组重排选育维吉尼亚霉素高产菌[D]. 仝倩倩.中国科学技术大学 2018
[3]小白链霉菌同步代谢葡萄糖和甘油合成ε-聚赖氨酸的生理机制研究[D]. 曾昕.江南大学 2016
[4]小白链霉菌响应酸性pH高产ε-聚赖氨酸的生理解析[D]. 任喜东.江南大学 2015
[5]产酸丙酸杆菌耐酸机制解析及代谢调控研究[D]. 管宁子.江南大学 2015
硕士论文
[1]基于细菌全基因组技术对AMDY2-9-2的氧化硫能力研究[D]. 闵婕.南京大学 2019
[2]小白链霉菌响应低pH胁迫生理机制的初步解析[D]. 王开方.江南大学 2019
[3]核糖体工程选育ε-聚赖氨酸高产菌及发酵pH调控策略优化[D]. 吴光耀.江南大学 2016
[4]Genome shuffling技术选育ε-聚赖氨酸高产菌[D]. 李凤.江南大学 2012
[5]ε-聚赖氨酸高产菌株选育与发酵过程优化[D]. 陈旭升.江南大学 2008
本文编号：3475236
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