苯丙胺脱氢酶的创制及其在手性胺合成中的应用

发布时间：2021-11-05 18:07

　　手性胺是合成许多药物、天然产物、精细化学品及生物活性分子的关键中间体,同时它也是一种高效的手性拆分剂。目前,工业上主要利用酸碱和过渡金属催化烯酰胺和烯胺等中间体不对称还原的方法制备手性胺。化学法制备手性胺存在能耗大、反应步骤多和最终得率较低等诸多不足,因此研究开发更加绿色高效的手性胺合成工艺显得尤为重要。胺脱氢酶可利用无机氨作为氨基供体,催化酮不对称胺化还原制备手性胺。该反应具有反应条件温和、原子经济性高、水是唯一的副产物等优点,因此胺脱氢酶是手性胺不对称合成的理想催化剂,在国际学术界和工业界引起广泛关注。目前,已报道的大部分胺脱氢酶是由L-氨基酸脱氢酶进化而来,其数量有限且底物谱窄;此外,酶的热稳定性也是影响其实际应用的关键因素。因此,本研究的主要目的是通过基因组数据库挖掘和分子改造手段,创制热稳定性好、催化效率高的苯丙胺脱氢酶,拓展其底物谱,促使其在手性胺合成中得到广泛应用。本文首先通过数据库挖掘法克隆得到4个苯丙氨酸脱氢酶,经过蛋白可溶性表达情况分析、活力及热稳定性表征,最终我们筛选得到一个来自于嗜热菌Geobacillus kaustophilus的苯丙氨酸脱氢酶GkPheDH... 

【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 手性胺
        1.1.1 手性胺的应用
        1.1.2 手性胺的合成
            1.1.2.1 手性胺的化学合成方法
            1.1.2.2 手性胺的生物合成途径
    1.2 胺脱氢酶的研究
        1.2.1 胺脱氢酶的发现
        1.2.2 胺脱氢酶的应用研究
    1.3 蛋白质工程
        1.3.1 酶的热稳定性改造
        1.3.2 酶的底物特异性改造
        1.3.3 酶的立体选择性改造
        1.3.4 高通量筛选方法的建立
    1.4 本课题研究的背景,目的及意义
    1.5 本课题的研究思路及内容提要
第二章 苯丙氨酸脱氢酶的基因挖掘及热稳定性筛选
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 主要试剂
        2.2.2 主要仪器
        2.2.3 菌种和培养基
    2.3 实验方法
        2.3.1 目的基因扩增
        2.3.2 构建重组质粒
        2.3.3 重组蛋白表达
        2.3.4 苯丙氨酸脱氢酶活力测定
        2.3.5 重组蛋白的纯化
        2.3.6 苯丙胺酸脱氢酶热稳定性测定
    2.4 实验结果
        2.4.1 苯丙胺酸脱氢酶基因的挖掘
        2.4.2 苯丙氨酸脱氢酶的基因克隆
        2.4.3 苯丙氨酸脱氢酶的表达
        2.4.4 苯丙氨酸脱氢酶的活力筛选
        2.4.5 苯丙氨酸脱氢酶的热稳定性筛选
    2.5 本章小结
第三章 苯丙胺脱氢酶的创制及其酶学性质研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 实验主要试剂
        3.2.2 实验主要仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 定点突变
        3.3.2 苯丙胺脱氢酶的活力测定
        3.3.3 胺脱氢酶纯化
        3.3.4 苯丙胺脱氢酶GkAmDH的酶学性质表征
            3.3.4.1 测定GkAmDH的最适温度
            3.3.4.2 测定GkAmDH的最适pH
            3.3.4.3 GkAmDH对有机溶剂的耐受性
            3.3.4.4 测定GkAmDH的表观动力学常数
            3.3.4.5 测定酶的操作稳定性
            3.3.4.6 外消旋胺标品的制备
            3.3.4.7 GkAmDH的底物谱探索
            3.3.4.8 对甲氧基苯丙胺及N-甲基对氟苯丙胺制备反应
    3.4 实验结果
        3.4.0 苯丙胺脱氢酶的创制
        3.4.1 苯丙胺脱氢酶的可溶表达情况
        3.4.2 苯丙胺脱氢酶的催化活力
        3.4.3 温度对苯丙胺脱氢酶GkAmDH活力的影响
        3.4.4 pH对苯丙胺脱氢酶GkAmDH活力的影响
        3.4.5 有机溶剂对苯丙胺脱氢酶GkAmDH活力的影响
        3.4.6 苯丙胺脱氢酶GkAmDH的表观动力学常数
        3.4.7 GkAmDH、FDH和GDH的操作稳定性
        3.4.8 苯丙胺脱氢酶GkAmDH的底物谱
    3.5 本章小结
第四章 苯丙胺脱氢酶的分子改造
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 实验试剂
        4.2.2 实验仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 定点(饱和)突变
        4.3.2 易错PCR
        4.3.3 同源建模与分子对接
        4.3.4 突变库的建立
            4.3.4.1 一级板
            4.3.4.2 二级板
        4.3.5 突变库的筛选
        4.3.6 蛋白纯化
        4.3.7 酶活力测定
        4.3.8 动力学常数测定
        4.3.9 底物谱测定
    4.4 实验结果
        4.4.1 BbAmDH的同源建模与分子对接
        4.4.2 BbAmDH的定点饱和突变
        4.4.3 BbAmDH的随机突变
        4.4.4 BbAmDH的突变位点分析
        4.4.5 GkAmDH的定点饱和突变
        4.4.6 GkAmDH突变体的底物谱
        4.4.7 苯丙胺脱氢酶的底物谱拓展
            4.4.7.1 GkPheDH的定点饱和突变
            4.4.7.2 Lys77X/N276X双点组合突变
    4.5 本章小结
结论与展望
参考文献
附录
攻读硕士期间撰写的论文和专利
致谢



本文编号：3478265