皱褶假丝酵母脂肪酶CRL1在毕赤酵母的高效表达及催化合成维生素E醋酸酯

发布时间：2022-07-08 14:59

　　皱褶假丝酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase,CRL）被认为是一种多才多艺、很有前景的生物催化剂,在制药、食品、化妆品、能源等领域具有广泛的应用。CRL商品酶主要由野生型菌株ATCC 14830和Type VII生产,目前已知由8种同工酶组成,其中CRL1具有最高的表达量和酶活力。不同商品酶之间由于同工酶的成分和比例不同,在底物选择性和催化效率上表现出显著差异。分离或生产单一的皱褶假丝酵母脂肪酶,尤其是CRL1,对开展进一步研究工作具有重要意义。毕赤酵母是目前应用最为广泛的外源蛋白表达系统,有利于外源蛋白的高效表达和工业生产。毕赤酵母表面展示体系是一种经济有效的酶固定化手段,可以有效提高酶的稳定性和重复利用效果、降低生产成本。本文以毕赤酵母为宿主细胞,分别构建皱褶假丝酵母脂肪酶CRL1的高效分泌表达和高效表面展示重组菌株,发酵生产脂肪酶催化剂。在此基础上,研究了两种类型重组CRL1的酶学性质,然后建立并优化了无溶剂体系中CRL1催化合成维生素E醋酸酯的绿色制备工艺体系,为其大规模工业化应用奠定了基础。本文的主要研究内容和结果如下:（1）将经密码子优化的CRL1基因克隆... 

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 脂肪酶简介
        1.1.1 脂肪酶的来源
        1.1.2 脂肪酶的结构特点
        1.1.3 脂肪酶的应用
    1.2 皱褶假丝酵母脂肪酶
        1.2.1 皱褶假丝酵母脂肪酶简介
        1.2.2 皱褶假丝酵母脂肪酶的克隆表达
        1.2.3 皱褶假丝酵母脂肪酶的生化结构
        1.2.4 皱褶假丝酵母脂肪酶的应用
    1.3 毕赤酵母表达系统
        1.3.1 毕赤酵母表达系统的特点
        1.3.2 提高外源蛋白表达的策略
        1.3.3 毕赤酵母表面展示系统
    1.4 维生素E衍生物
        1.4.1 维生素E衍生物简介
        1.4.2 酶法合成维生素E醋酸酯
    1.5 本课题的研究意义和研究内容
        1.5.1 本课题的研究意义
        1.5.2 本课题的研究内容
第二章 皱褶假丝酵母脂肪酶CRL1在毕赤酵母的高效分泌表达及酶学性质分析
    2.1 引言
    2.2 材料与仪器
        2.2.1 主要仪器
        2.2.2 主要试剂
        2.2.3 菌株和质粒
        2.2.4 培养基的配置
        2.2.5 溶液的配置
    2.3 实验方法
        2.3.1 分泌型重组质粒的构建
        2.3.2 分泌型重组菌株的构建和筛选
        2.3.3 蛋白纯化
        2.3.4 酶学性质分析
        2.3.5 数据统计分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 分泌型重组质粒的构建
        2.4.2 分泌型重组毕赤酵母菌株的构建和筛选
        2.4.3 启动子和信号肽改造对分泌表达水平的影响
        2.4.4 分泌型重组CRL1的蛋白纯化
        2.4.5 分泌型重组CRL1的酶学性质
        2.4.6 高表达分泌型重组株的3L补料分批发酵
    2.5 本章小结
第三章 皱褶假丝酵母脂肪酶CRL1在毕赤酵母的高效表面展示及酶学性质分析
    3.1 引言
    3.2 材料与仪器
        3.2.1 主要仪器
        3.2.2 主要试剂
        3.2.3 菌株、质粒和引物
        3.2.4 培养基的配置
        3.2.5 溶液的配置
    3.3 实验方法
        3.3.1 表面展示重组质粒的构建
        3.3.2 表面展示重组菌株的构建和筛选
        3.3.3 多拷贝重组菌株的构建和筛选
        3.3.4 重组菌株的基因拷贝数鉴定
        3.3.5 毕赤酵母重组菌株的胞内蛋白提取
        3.3.6 流式细胞仪检测分析
        3.3.7 酵母细胞载酶量测定
        3.3.8 表面展示CRL1酶学性质测定
        3.3.9 数据统计分析
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 毕赤酵母表面展示系统的构建和筛选
        3.4.2 多拷贝表面展示重组菌株的构建和筛选
        3.4.3 多拷贝表面展示重组菌株过表达HAC1转录因子
        3.4.4 流式细胞仪检测分析
        3.4.5 表面展示重组菌株展示效率分析
        3.4.6 表面展示CRL1的酶学性质分析
        3.4.7 高表达表面展示重组菌株的3L补料分批发酵
    3.5 本章小结
第四章 皱褶假丝酵母脂肪酶CRL1在无溶剂体系中催化合成维生素E醋酸酯
    4.1 引言
    4.2 材料与仪器
        4.2.1 主要试剂
        4.2.2 主要仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 硝酸法鉴定D-α-生育酚
        4.3.2 脂肪酶催化剂的制备
        4.3.3 催化反应体系
        4.3.4 催化反应条件优化
        4.3.5 体系放大及产物纯化
        4.3.6 HPLC-UV定量检测方法
        4.3.7 其他分离检测方法
        4.3.8 产物纯化
        4.3.9 产物表征
        4.3.10 数据统计分析
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 脂肪酶和酰基供体筛选
        4.4.2 反应条件优化
        4.4.3 产物分离纯化
        4.4.5 产物表征
    4.5 本章小结
结论与展望
    结论
    创新点
    展望
参考文献
攻读硕士学位期间取得的研究成果
致谢
附件



本文编号：3657238