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海参i-型溶菌酶发酵生产及酶学性质研究

发布时间:2022-10-03 18:56
  溶菌酶,又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,是一种能水解微生物细胞壁黏多糖的碱性水解酶,其广泛分布于不同生物体中。溶菌酶作为天然的蛋白质,对动物无害,无毒,不会残留在体内。海参i-型溶菌酶基因由本实验室于2007年首次分离和鉴定,并已将其目的蛋白分别在原核细胞和真核细胞中高效表达。本课题以实验室已经构建并表达的海参i-型溶菌酶蛋白的毕赤酵母基因工程菌HS3-1为发酵出发菌株。首先采用5 L发酵罐对基因工程菌HS3-1进行发酵小试,种子培养阶段使用YPD和BMGY培养基,BSM为发酵罐培养基。发酵罐各参数设定为温度30℃,pH 6.0,搅拌速度500 rpm/min,溶氧30%。种子液在发酵罐培养过程中,当BSM培养基中甘油耗尽后进入甘油补料阶段,其补料的速度为18.15 mL/h/L,时间为5 h。当菌体湿重达到180-220 g/L时,酵母细胞饥饿1 h。最后进行甲醇诱导阶段,利用甲醇检测器实时监测发酵液中甲醇浓度,并将其控制在1%(V/V),诱导时间为96 h。分析得到发酵液酶产量为58 mg/L,经过镍离子亲和层析后得到海参溶菌酶精制产品,其酶活力为1238 U/mg。在5 L发酵罐的... 

【文章页数】:76 页

【学位级别】:硕士

【文章目录】:
摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 溶菌酶的简介
        1.1.1 溶菌酶的性质和结构
        1.1.2 溶菌酶的基因结构
        1.1.3 溶菌酶的生物学功能
        1.1.4 溶菌酶的分类
    1.2 溶菌酶的应用
        1.2.1 溶菌酶在食品中的应用
        1.2.2 溶菌酶在养殖中的应用
        1.2.3 溶菌酶在医疗中的应用
    1.3 毕赤酵母的简述
        1.3.1 毕赤酵母的应用
        1.3.2 甲醇营养型毕赤酵母的优点
    1.4 溶菌酶的分离纯化
        1.4.1 结晶法
        1.4.2 亲和层析法
        1.4.3 超滤
        1.4.4 反胶团萃取
    1.5 溶菌酶的纯度检测
        1.5.1 高效液相色谱法
        1.5.2 质谱分析
    1.6 研究目的、内容和技术路线
        1.6.1 研究目的和内容
        1.6.2 技术路线
第二章 海参i-型溶菌酶5L和30L发酵及放大培养
    2.1 引言
    2.2 材料及仪器
        2.2.1 种子液培养基
        2.2.2 发酵罐培养基
        2.2.3 蛋白分离纯化常用溶液和缓冲溶液
        2.2.4 实验仪器与设备
    2.3 发酵罐(5L)发酵培养
        2.3.1 电极的校正
        2.3.2 接种及初始培养
        2.3.3 甘油流加阶段
        2.3.4 甲醇诱导阶段
        2.3.5 海参i-型溶菌酶的纯化
        2.3.6 抑菌活性分析方法
    2.4 发酵罐(30L)发酵培养
        2.4.1 发酵罐的灭菌
        2.4.2 接种及基础生长阶段
        2.4.3 甘油流加阶段
        2.4.4 甲醇诱导阶段
        2.4.5 i-型溶菌酶蛋白的分离与纯化
        2.4.6 表达产物的SDS-PAGE分析
        2.4.7 溶菌酶酶活检测
    2.5 结果与分析
        2.5.1 发酵罐(5L)发酵培养结果
        2.5.2 发酵罐(30L)发酵培养结果
    2.6 本章小结
第三章 海参i-型溶菌酶液相和质谱分析
    3.1 引言
    3.2 材料及仪器
        3.2.1 样品
        3.2.2 仪器与试剂
        3.2.3 标准溶液的配制
        3.2.4 样品溶液的配制
        3.2.5 液相色谱条件
        3.2.6 高效液相色谱测定
        3.2.7 质谱分析
    3.3 试验步骤
        3.3.1 高效液相色谱使用方法
        3.3.2 MALDI-TOF质谱仪使用方法
    3.4 结果与分析
        3.4.1 高效液相测定与分析
        3.4.2 MALDI-TOF质谱测定与分析
    3.5 本章小结
第四章 海参i-型溶菌酶酶学性质及空间结构研究
    4.1 引言
    4.2 仪器与试剂
        4.2.1 实验仪器与设备
        4.2.2 药品与试剂
    4.3 方法与步骤
        4.3.1 溶菌酶活性测定
        4.3.2 pH对溶菌酶活性及稳定性的影响
        4.3.3 温度对溶菌酶活性及稳定性的影响
        4.3.4 金属离子对溶菌酶活性的影响
        4.3.5 常用助溶剂对溶菌酶活性的影响
        4.3.6 米氏常数(Km)测定
    4.4 结果与分析
        4.4.1 pH对溶菌酶活性及稳定性影响的测定与分析
        4.4.2 温度对溶菌酶活性及稳定性影响的测定与分析
        4.4.3 金属离子对溶菌酶活性的影响
        4.4.4 常用试剂对溶菌酶活性的影响
        4.4.5 米氏常数测定
        4.4.6 最低抑菌浓度实验
        4.4.7 海参i-型溶菌酶空间结构研究
    4.5 本章小结
第五章 结论
讨论与展望
参考文献
研究生期间发表论文情况
致谢



本文编号:3684638

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