大肠杆菌生物合成乳清酸途径的优化

发布时间：2023-04-17 00:33

　　乳清酸又称维生素B13,在生理上具有十分关键的作用,可应用于医药、化学品、化妆品等领域。乳清酸通过化学法合成的成本高、污染大,而利用微生物发酵法生产乳清酸是一种绿色环保的替代方法。本研究通过代谢工程的策略与技术对大肠杆菌BW25113野生型菌株的乳清酸合成途径进行优化,首先通过在关键酶基因前整合T7启动子、转化重组质粒以及提高前体供应水平的策略增强途径的通量,使乳清酸产量达到了 82.90mg/L。为了避免乳清酸在DNA复制的过程中被大量消耗,对乳清酸下游的磷酸核糖转移酶基因pyrE进行敲除,得到乳清酸积累菌株BW-OR13,乳清酸产量大幅提高至1011.70 mg/L。在此基础上,分别敲除基因argF和dctA,以敲除旁路代谢及修饰乳清酸转运系统,结果并不理想。通过转化表达磷酸核糖转移酶的质粒对尿嘧啶进行回补,虽改善了菌株生长,却使乳清酸产量发生下降。进一步对菌株BW-OR13进行模块优化,最高可得到的乳清酸产量为1126.39 mg/L。进一步改善副产物乙酸的积累情况,对培养基进行优化,使乳清酸产量提高至2185.23 mg/L。通过敲除基因iclR和arcA激活乙醛酸循环,使发酵...

【文章页数】：98 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
学位论文数据集
摘要
Abstract
英文名词缩写表
第一章 绪论
    1.1 乳清酸
        1.1.1 理化性质
        1.1.2 应用
    1.2 乳清酸的合成方法
        1.2.1 乳清酸化学合成
        1.2.2 乳清酸生物合成
    1.3 大肠杆菌乳清酸合成
        1.3.1 嘧啶核苷合成途径
        1.3.2 乳清酸合成关键酶
        1.3.3 乳清酸合成前体
        1.3.4 乳清酸分解代谢
        1.3.5 乳清酸合成旁路代谢
        1.3.6 乳清酸转运蛋白
        1.3.7 TCA循环与乙醛酸循环的影响
        1.3.8 糖酵解途径的影响
    1.4 RED同源重组技术
    1.5 CRISPR/Cas9系统
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 引物、质粒、菌株
        2.1.2 实验仪器、试剂、培养基
    2.2 实验方法
        2.2.1 引物设计
        2.2.2 PCR
        2.2.3 质粒提取
        2.2.4 酶切与连接
        2.2.5 琼脂糖凝胶电泳
        2.2.6 DNA回收
        2.2.7 转化
        2.2.8 转化子筛选
        2.2.9 RED基因重组技术
        2.2.10 CRISPR基因编辑技术
        2.2.11 发酵
        2.2.12 样品分析
第三章 乳清酸内源合成途径的增强
    3.1 T7启动子的整合
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验方法
        3.1.3 实验结果与讨论
    3.2 模块优化
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验方法
        3.2.3 实验结果与讨论
    3.3 前体供应水平的提高
        3.3.1 实验材料
        3.3.2 实验方法
        3.3.3 实验结果与讨论
    3.4 本章小结
第四章 乳清酸积累菌株的构建及筛选
    4.1 乳清酸合成下游基因的敲除
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 实验方法
        4.1.3 实验结果与讨论
    4.2 精氨酸合成相关基因的敲除
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验方法
        4.2.3 实验结果与讨论
    4.3 乳清酸转运相关基因的敲除
        4.3.1 实验材料
        4.3.2 实验方法
        4.3.3 实验结果与讨论
    4.4 生长状况的改善
        4.4.1 实验材料
        4.4.2 实验方法
        4.4.3 实验结果与讨论
    4.5 模块优化
        4.5.1 实验材料
        4.5.2 实验方法
        4.5.3 实验结果与讨论
    4.6 本章小结
第五章 副产物乙酸的减少
    5.1 培养基优化
        5.1.1 实验材料
        5.1.2 实验方法
        5.1.3 实验结果与讨论
    5.2 乙醛酸循环的激活
        5.2.1 实验材料
        5.2.2 实验方法
        5.2.3 实验结果与讨论
    5.3 糖酵解途径弱化
        5.3.1 实验材料
        5.3.2 实验方法
        5.3.3 实验结果与讨论
    5.4 本章小结
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 展望
参考文献
附录
致谢
作者和导师简介
附件



本文编号：3792200