代谢工程改造拜氏梭菌强化丁醇合成

发布时间：2023-04-20 22:51

　　生物丁醇作为石油替代品,具有能量密度高、挥发性低、腐蚀性弱等物理特性。拜氏梭菌是用于生物法生产丁醇的极具潜力的工业菌株,但是利用拜氏梭菌生产丁醇也存在一些缺陷,如丁醇产量低,发酵副产物丙酮比例较高,木糖利用效率低,以及适用于拜氏梭菌的基因编辑技术有限等。因此,本论文主要针对以上问题进行了探究。参与调控因子Spo0A磷酸化的组氨酸激酶在一些产溶剂梭菌,例如丙酮丁醇梭菌中可以调控溶剂合成和孢子分化,而在拜氏梭菌中还没有相关研究。通过同源比对,筛选出6个与丙酮丁醇梭菌组氨酸激酶同源序列超过30%的候选基因,包括cbei2073,cbei4484,cbei2087,cbei2435,cbei4925和cbei1553。采用CRISPR-Cas9n基因编辑技术对上述基因进行删除。敲除基因cbei2073和cbei4484使丁醇产量发生显著性的变化,丁醇浓度分别从9.8 g/L提高到13.8 g/L和11.5 g/L,分别提高了40.8%和17.3%。而且,两株突变菌的丁醇合成速度更快,丁醇生产强度相对于野生菌株分别提高了40.0%和20.0%,证明这两个组氨酸激酶在拜氏梭菌中对胞内的产物合成代谢...

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
引言
1 文献综述
    1.1 生物能源的现状
    1.2 丁醇概述
        1.2.1 丁醇的性质和用途
        1.2.2 丁醇的生物生产方法
        1.2.3 ABE发酵目前面临的挑战
    1.3 CRISPR-Cas技术简介
        1.3.1 CRISPR-Cas技术的发展历史
        1.3.2 CRISPR-Cas系统功能及分类
        1.3.3 CRISPR-Cas9 技术在细菌基因编辑中的应用
    1.4 组氨酸激酶对梭菌的调控作用
    1.5 课题主要意义及主要研究内容
2 组氨酸激酶对拜氏梭菌的调控
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 菌株及质粒
        2.2.2 主要实验仪器
        2.2.3 主要实验试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 培养基的配制
        2.3.2 选择及预测孤立的组氨酸激酶编码基因
        2.3.3 PAM序列的选择及重组质粒的构建
        2.3.4 电转化及阳性转化子的验证保菌
        2.3.5 ABE发酵验证
        2.3.6 孢子数量
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 质粒构建结果及电转化结果
        2.4.2 组氨酸激酶失活对溶剂合成的影响
        2.4.3 组氨酸激酶失活对孢子数量的影响
    2.5 本章小结
3 乙酰乙酸脱羧酶编码基因adc对拜氏梭菌的影响
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 菌株及质粒
        3.2.2 主要实验仪器
        3.2.3 主要实验试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 培养基配制
        3.3.2 菌株Δcbei3835和Δcbei2073/3835 的构建
        3.3.3 酸重吸收基因的过表达
        3.3.4 基因cbei3835(adc)的抑制表达
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 菌株构建结果
        3.4.2 敲除adc基因对发酵产物的影响
        3.4.3 强化酸重吸收途径对发酵产物的影响
        3.4.4 添加甲基紫精对发酵产物的影响
        3.4.5 抑制adc基因表达对发酵产物的影响
    3.5 本章小结
4 拜氏梭菌利用木糖产丁醇能力的系统改造
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 菌株及质粒
        4.2.2 主要实验仪器和实验试剂
    4.3 实验方法
        4.3.1 培养基配制
        4.3.2 重组质粒的构建
        4.3.3 电转化及验证、保菌
        4.3.4 ABE发酵验证
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 菌株构建结果
        4.4.2 ABE发酵验证结果
    4.5 本章小结
结论
展望
创新点
参考文献
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢



本文编号：3795316