基于生物计算对SMG1和PCL脂肪酶热稳定性改造的应用基础研究

发布时间：2023-05-07 02:18

　　偏甘油酯脂肪酶(mono-and di-acylglycerol lipase(DGL))在油脂和化工行业中具有重要应用价值。但是,目前报道的DGL都属于中温酶,严重限制了其工业应用,需要对其热稳定性进行改造。本论文以偏甘油酯脂肪酶SMG1和PCL为研究对象,通过计算生物学方法开展热稳定性改造。具体包括以下几个方面的内容:1.运用计算机辅助设计对脂肪酶SMG1的热稳定性研究。运用三种软件RosettaDesign、FoldX和ABACUS对SMG1进行热稳定性突变设计,最后得到18个Tm值提高的单点突变;将上述18个单点突变位点叠加组合,得到最佳突变体S5(Q34P+A37P+M176V+G177A+M294R),其Tm值提升6℃,最适温度提高5℃;在S5的基础上,进行了二轮设计,得到Tm值提升6℃的单点Q282F,酶活性测定发现该突变体对酶活性影响显著,基于结构分析,可知突变后的氨基酸位点形成空间位阻,并且与F278形成的π-π相互作用也会造成空间位阻。2.氨基酸替换结合结构分析对脂肪酶PCL的热稳定性改造。基于计算生物学方法获得的微生物热稳定蛋白质的氨基酸组成特征,通过将脂肪酶PC...

【文章页数】：92 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号表
第一章 绪论
    1.1 热稳定性酶概述
        1.1.1 酶热稳定性的定义及其常用表示方法
        1.1.2 热稳定性酶的应用
        1.1.3 影响酶热稳定性的因素
    1.2 酶分子热稳定性改造策略
        1.2.1 非理性设计
        1.2.2 理性设计
        1.2.3 半理性设计
    1.3 偏甘油酯脂肪酶
        1.3.1 偏甘油酯脂肪酶SMG
        1.3.2 偏甘油酯脂肪酶PCL
    1.4 本课题研究意义和主要内容
第二章 计算机设计SMG1热稳定性突变体
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 菌株与质粒
        2.2.2 培养基及溶液配制
        2.2.3 引物合成与DNA测序
        2.2.4 主要仪器
        2.2.5 计算分析软件
    2.3 突变体设计与构建
        2.3.1 突变体设计
        2.3.2 突变体构建
    2.4 实验结果
        2.4.1 Rosetta计算后筛选得到的有益突变体
        2.4.2 FoldX计算筛选后得到的有益突变体
        2.4.3 ABACUS计算筛选后得到的有益突变体
        2.4.4 结构上合理位点
    2.5 本章小结
第三章 SMG1突变体表达纯化和热稳定性分析
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 表达菌株
        3.2.2 培养基
    3.3 实验方法
        3.3.1 突变质粒和表达菌株构建
        3.3.2 SMG1和突变体蛋白诱导表达
        3.3.3 菌液处理
        3.3.4 目的蛋白纯化和热稳定性检测
    3.4 叠加突变体构建与热稳定性检测
        3.4.1 叠加突变体构建
        3.4.2 叠加突变体表达纯化及热稳定性检测
    3.5 叠加突变体酶活性及酶学性质检测
    3.6 二轮计算机设计突变体
    3.7 实验结果
        3.7.1 突变体蛋白表达情况汇总
        3.7.2 突变体Tm值测定结果汇总
        3.7.3 叠加突变体构建路线和表达情况
        3.7.4 叠加突变体热稳定性及酶学性质测定
        3.7.5 二轮计算筛选突变体
        3.7.6 二轮计算突变体构建、表达及热稳定性测定
        3.7.7 最优突变体酶活性测定
    3.8 本章小结
第四章 氨基酸替换结合结构分析对PCL热稳定性改造
    4.1 引言
    4.2 突变体设计思路
    4.3 实验方法
        4.3.1 突变体构建
        4.3.2 突变体表达和纯化
    4.4 活性检测、热稳定性评估及其它酶学性质测定
        4.4.1 滴定法测定酶活
        4.4.2 热稳定评估
        4.4.3 PCL与突变体生化性质测定
        4.4.4 Km、Kcat值测定
    4.5 动力学（MD）分析热稳定性
    4.6 实验结果
        4.6.1 突变体设计结果
        4.6.2 突变体纯化结果
        4.6.3 Tm值和T1/2值测定结果
        4.6.4 生化性质测定
        4.6.5 Km、Kcat值测定结果
        4.6.6 动力学结果分析
    4.7 本章小结
第五章 两种热稳定性改造方法总结和比较
    5.1 引言
    5.2 两种热稳定性改造方法总结
        5.2.1 计算机结合结构分析的蛋白质热稳定性设计
        5.2.2 氨基酸替换结合蛋白质的结构分析的蛋白质热稳定性设计
        5.2.3 两种酶热稳定性方法比较
    5.3 本章小结
结论与展望
参考文献
攻读硕士学位期间取得的研究成果
致谢
附件



本文编号：3810049