酪氨酸酚裂解酶改造强化全细胞催化合成左旋多巴

发布时间：2023-10-30 20:40

　　左旋多巴(3,4-2dihydroxylphenylalanine,L-DOPA)是治疗帕金森综合症的主要药物,随着我国人口老龄化速度的加快,对左旋多巴的需求也迅速增加。目前应用于工业化生产L-DOPA的方法主有化学合成和微生物酶催化法。化学合成法虽然具有纯度高和收率高的优势,但也存在步骤繁杂、环境污染严重、成本较高等问题;微生物酶催化法具有工艺简单、产量稳定、条件温和等优点,具有广阔的工业化应用前景。原始菌株(如Erwinia herbicola等)中的酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol-lyase,TPL)活性普遍较低,无法直接用于高效催化合成L-DOPA。为了提高酪氨酸酚裂解酶表达量与酶活,本研究在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达来源于草生欧文式菌(Erwinia herbicola)的TPL,通过易错PCR技术对酪氨酸酚裂解酶基因进行定向进化,并分别在摇瓶和5 L发酵罐水平上对重组菌的培养条件以及催化合成L-DOPA的条件进行了优化,提高了酪氨酸酚裂解酶的催化效率和L-DOPA的产量。论文主要研究结果如下:(1)结合易错PCR和高通量筛选技术定...

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 左旋多巴
        1.1.1 左旋多巴的概述
        1.1.2 左旋多巴的合成
    1.2 酪氨酸酚裂解酶
        1.2.1 酪氨酸酚裂解酶简介
        1.2.2 酪氨酸酚裂解酶催化机理
        1.2.3 酪氨酸酚裂解酶的应用现状
    1.3 立题依据与研究内容
        1.3.1 立题依据
        1.3.2 研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 主要培养基
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要溶液
        2.1.5 主要仪器
    2.2 分子生物学操作
        2.2.1 易错PCR
        2.2.2 PCR产物的纯化回收
        2.2.3 突变PCR产物的连接与重组质粒的转化
        2.2.4 阳性转化子的鉴定
    2.3 培养方法
        2.3.1 菌种培养及全细胞催化剂的制备
        2.3.2 全细胞催化合成L-DOPA
        2.3.3 重组大肠杆菌培养条件优化
        2.3.4 重组大肠杆菌诱导条件优化
        2.3.5 全细胞催化条件优化
    2.4 纯化与分析方法
        2.4.1 酶的纯化
        2.4.2 蛋白浓度及酶活测定
        2.4.3 TPL酶学性质的测定
        2.4.4 菌体浓度测定
        2.4.5 L-DOPA液相检测方法
        2.4.6 甘油检测方法
        2.4.7 高通量筛选方法
第三章 结果与讨论
    3.1 易错PCR反应体系建立及TPL基因突变库的构建
        3.1.1 易错PCR条件的优化
        3.1.2 TPL基因突变体库的构建与筛选
        3.1.3 突变TPL(突变株3-2F9)的表达与纯化
        3.1.4 突变酶的最适温度和温度稳定性
        3.1.5 突变酶的最适pH和 pH稳定性
        3.1.6 突变酶的动力学参数测定及突变位点分析
    3.2 摇瓶水平上发酵生产TPL及催化合成L-DOPA的条件优化
        3.2.1 重组E.coli BL21 的培养条件优化
        3.2.2 重组E.coli BL21 产酶条件优化
        3.2.3 L-DOPA合成条件的优化
    3.3 重组大肠杆菌在5 L罐上生产L-DOPA的高密度发酵研究
        3.3.1 重组大肠杆菌的分批发酵
        3.3.2 搅拌转速对酪氨酸酚裂解酶分批发酵的影响
        3.3.3 DO-Stat流加控制培养
        3.3.4 诱导起始时间的优化
        3.3.5 底物流加方式的优化
结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文



本文编号：3859153