调控天冬氨酸代谢途径提高Lactococcus lactis NZ9000的酸胁迫抗性

发布时间：2023-11-26 15:55

　　乳酸菌具有优良的益生功能,在食品和医药等领域被广泛应用。然而在发酵生产、储藏和消化吸收的过程中菌株会面临严峻的酸胁迫,严重影响菌株的生长和益生功能的发挥,因此提高其酸胁迫抗性尤为迫切。前期研究中,我们首次发现天冬氨酸的积累可有效增强菌株的酸胁迫抗性,但目前对其研究还相对较少,作用机制尚不清晰。因此,本论文以Lactococcus lactis NZ9000为研究对象,通过外源添加天冬氨酸(Asp)的方式验证其作用效果,解析其作用机制;并分别过量表达天冬酰胺酶和酸性氨基酸转运蛋白AcaP提高胞内Asp的积累量,进而增强L.lactis NZ9000的酸胁迫抗性。首先通过外源添加Asp的方式,证实了Asp的作用效果,在pH 6.0、5.5、5.0条件下,与对照组相比,实验组L.lactis NZ9000生物量分别增加23.9%、63.3%和463.0%;pH 4.0条件下胁迫培养3.5 h,实验组存活率为对照组的75.0倍。考查了胁迫条件下Asp对L.lactis NZ9000能量和氨基酸代谢途径中关键基因转录水平的影响,发现实验组糖酵解途径中的基因转录上调;Glu代谢途径中谷氨酸脱羧酶基...

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 概述
        1.1.1 乳酸菌简介
        1.1.2 乳酸菌的应用
        1.1.3 乳酸菌面临的环境胁迫
    1.2 国内外研究进展
        1.2.1 乳酸菌的酸胁迫应对机制
        1.2.2 提高乳酸菌酸胁迫抗性的策略
    1.3 本论文立题依据和研究意义
    1.4 本论文主要研究内容
第二章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 试剂
        2.1.3 仪器
        2.1.4 培养基及培养条件
    2.2 验证Asp提高L.lactis NZ9000的酸胁迫抗性
        2.2.1 Asp最适添加浓度的测定
        2.2.2 Asp对L.lactis NZ9000生长性能影响的测定
        2.2.3 L.lactis NZ9000乳酸产量的测定
        2.2.4 L.lactis NZ9000酸胁迫抗性分析
    2.3 Asp作用机制解析
        2.3.1 荧光实时定量PCR
        2.3.2 L.lactis NZ9000胞内氨基酸含量的测定
        2.3.3 L.lactis NZ9000胞内微环境分析
    2.4 过量表达天冬酰胺酶提高L.lactis NZ9000的酸胁迫抗性
        2.4.1 L.lactis NZ9000基因组的提取与ansB基因的扩增
        2.4.2 pNZ8148质粒的提取
        2.4.3 L.lactis NZ9000感受态的制备
        2.4.4 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB表达载体的构建与转化
        2.4.5 天冬酰胺酶的诱导表达、酶活力测定
        2.4.6 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB生长和产酸性能的测定
        2.4.7 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB胞内氨基酸含量的测定
        2.4.8 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB存活率的测定
        2.4.9 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB关键基因转录水平
        2.4.10 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB胞内微环境分析
    2.5 过量表达AcaP转运蛋白提高L.lactis NZ9000的酸胁迫抗性
        2.5.1 ylcA基因的扩增
        2.5.2 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA表达载体的构建与转化
        2.5.3 AcaP蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析
        2.5.4 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA存活率的测定
        2.5.5 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA关键基因转录水平
        2.5.6 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA胞内微环境分析
第三章 结果与讨论
    3.1 Asp提高L.lactis NZ9000酸胁迫抗性
        3.1.1 Asp最适添加浓度的确定
        3.1.2 Asp对L.lactis NZ9000生长性能的影响
        3.1.3 Asp对L.lactis NZ9000乳酸产量的影响
        3.1.4 Asp对L.lactis NZ9000酸胁迫抗性的影响
    3.2 Asp作用机制解析
        3.2.1 Asp对L.lactis NZ9000关键基因转录水平的影响
        3.2.2 Asp对L.lactis NZ9000胞内Glu和GABA含量的影响
        3.2.3 Asp对L.lactis NZ9000胞内微环境的影响
    3.3 过量表达天冬酰胺酶提高L.lactis NZ9000的酸胁迫抗性
        3.3.1 天冬酰胺酶的诱导表达和酶活测定
        3.3.2 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB生长性能和乳酸产量的测定
        3.3.3 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB胞内Asp和Glu含量的测定
        3.3.4 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB存活率的测定
        3.3.5 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB关键基因的转录水平分析
        3.3.6 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansB胞内ATP和氨基酸含量的测定
        3.3.7 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ansBΔpH_i和胞内NH4
+含量的测定
    3.4 过量表达AcaP转运蛋白提高L.lactis NZ9000的酸胁迫抗性
        3.4.1 AcaP蛋白的诱导表达和胞内Asp含量的测定
        3.4.2 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA生长性能和乳酸产量的测定
        3.4.3 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA存活率的测定
        3.4.4 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA关键基因的转录水平分析
        3.4.5 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcA胞内ATP和氨基酸含量的测定
        3.4.6 L.lactis NZ9000-pNZ8148-ylcAΔpH_i和Δφ的测定
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文和专利



本文编号：3868090

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