转氨酶yhxA的可溶表达及其催化性能的改造

发布时间：2024-01-23 15:55

　　手性胺是指小分子化合物手性中心的取代基含有氨基的一类化合物,是多数医药、农药的重要中间体。例如,治疗糖尿病的药物西他列汀、抗生素青霉素及广谱触杀型除草剂草铵膦等都是手性胺化合物。转氨酶制备手性胺的方法有两种,分别为动力学拆分外消旋的胺及从前手性酮不对称合成手性胺。其中不对称合成制备手性胺的理论产率能够达到100%,使转氨酶在生产工业领域具有强大的应用前景。手性内酰胺是抗生素中十分重要且具有广泛生物活性的中间体。转氨酶可催化醛酯或酮酯进行生物转化,不对称合成相应的手性胺,随后通过自发的分子内环化反应获得具有光学活性的手性内酰胺中间体。由于目前催化这一反应的转氨酶种类较少,本论文对催化手性内酰胺不对称合成进行了转氨酶的基因挖掘,最终从数据库中筛选到与模板酶相似度为29.4%来源枯草杆菌的假定转氨酶yhxA(NCBI:CAB12754.2),氨基酸序列全长450 aa,与模板转氨酶同属乙酰鸟氨酸转氨酶家族,随后对yhxA进行了可溶表达。为了实现yhxA的可溶表达,选择了利于蛋白NI-NTA亲和层析纯化的pET表达系统。但在pET-21a,pET-28a和pET-28b上未能获得yhxA的可溶...

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
缩略语表
第一章 绪论
    1.1 转氨酶
        1.1.1 转氨酶简介
        1.1.2 转氨酶分类
        1.1.3 转氨酶催化机制
        1.1.4 转氨酶的底物特异性
        1.1.5 转氨酶催化反应的类型
        1.1.6 转氨酶的研究进展
    1.2 基因挖掘
        1.2.1 基于功能的实验分析
        1.2.2 由结构预测蛋白质功能
    1.3 酶的改造
        1.3.1 酶的定向进化
        1.3.2 酶的理性设计
    1.4 本论文的研究思想
第二章 yhxA的可溶表达
    2.1 引言
    2.2 实验材料和仪器
        2.2.1 菌种与质粒
        2.2.2 主要试剂
        2.2.3 引物设计
        2.2.4 溶液配制
        2.2.5 主要实验仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 yhxA基因挖掘
        2.3.2 yhxA基因克隆
        2.3.3 多聚氨基酸修饰yhxA的基因克隆
        2.3.4 yhxA重组菌的构建
        2.3.5 多聚氨基酸修饰yhxA重组菌的构建
        2.3.6 yhxA与多聚氨基酸修饰yhxA的诱导表达
        2.3.7 多聚氨基酸修饰yhxA的纯化
        2.3.8 多聚氨基酸修饰yhxA的活力测定
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 yhxA的基因挖掘与表达
        2.4.2 多聚氨基酸修饰yhxA的构建与表达
        2.4.3 多聚氨基酸修饰yhxA表达条件的优化
        2.4.4 多聚氨基酸修饰yhxA的纯化
        2.4.5 多聚氨基酸修饰yhxA的活力测定
    2.5 小结
第三章 yhxA催化性能的改造
    3.1 引言
    3.2 实验材料和仪器
        3.2.1 主要试剂
        3.2.2 实验仪器
        3.2.3 引物设计
    3.3 实验方法
        3.3.1 yhxA的同源模建
        3.3.2 yhxA的分子对接
        3.3.3 多聚氨基酸修饰yhxA的饱和突变
        3.3.4 yhxA的饱和突变
        3.3.5 yhxA突变体催化活性
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 yhxA的同源模建
        3.4.2 yhxA的分子对接
        3.4.3 多聚氨基酸修饰yhxA的饱和突变
        3.4.4 yhxA的饱和突变
        3.4.5 yhxA突变体表达的优化
    3.5 小结
第四章 yhxAs的酶学性质及催化性能
    4.1 前言
    4.2 实验仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 最适温度与热稳定性的测定
        4.3.2 最适pH与 pH稳定性的测定
        4.3.3 金属离子稳定性的测定
        4.3.4 筛选yhxAs的底物范围
        4.3.5 不对称合成手性内酰胺
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 yhxAs的最适温度与热稳定性
        4.4.2 yhxAs的最适pH及 pH稳定性
        4.4.3 yhxAs的金属离子稳定性
        4.4.4 yhxAs的底物范围
        4.4.5 yhxAs催化手性内酰胺不对称合成
    4.5 小结
第五章 结论
参考文献
附录
致谢



本文编号：3882944