乳及乳制品中碱性磷酸酶和乳过氧化物酶活性检测方法的评估及应用

发布时间：2020-04-03 04:36

【摘要】：牛奶可以为人体提供大量营养物质,但其中也存在很多致病微生物。合适的巴氏杀菌工艺可以杀灭牛奶中的致病微生物,也可以保持营养物质不被破坏。牛奶中的碱性磷酸酶和乳过氧化物酶活性就可以用于巴氏杀菌乳热处理加工工艺的评价。但目前国内关于碱性磷酸酶的检测标准NY/T 801-2004操作繁琐、耗时长、灵敏度低,已经不能满足乳品生产过程对卫生安全控制的需求,同时,也尚无关于乳过氧化物酶活性的检测标准。因此,本试验针对ISO 22160-2007中检测碱性磷酸酶活性的方法进行了评估,也对商品化试剂盒(Evergreen TERA~(TM))检测乳过氧化物酶活性的方法进行了评估,为之后新的行业标准的制定提供数据基础;同时本试验利用两种方法研究了不同热处理条件下巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶和乳过氧化物酶活性的变化,对巴氏杀菌工艺的评价方法提供依据。本试验还检测了市售巴氏杀菌乳中两种酶的活性,为牛奶加工生产和牛奶质量评价提供一定的数据基础。主要试验内容和结果如下:碱性磷酸酶活性检测方法的优化与评估:本方法优化了ISO 22160-2007中的方法,对方法的仪器选择性、基质选择性、干扰影响和样品稳定性进行检测,结果表明该方法可用于巴氏杀菌乳碱性磷酸酶活性的检测。同时对该方法的检出限、线性关系、回收率、日间日内差异、重复性、再现性均进行验证与评估,结果表明:检出限测定结果为18.4 mU/L,与方法中规定20 mU/L一致;生鲜乳含量与碱性磷酸酶活性0.00~1.00%范围内呈良好线性关系,回归方程y=10~6x 85.068,相关系数R~2=0.9971。回收率范围85.3%~105.6%,相对标准偏差范围2.5%~22.1%;日内差异相对标准偏差为9.4-10.7%,日间差异相对标准偏差为10.7%;同时在三家具有资质的检测单位中进行比对验证,各比对验证单位测试结果显示碱性磷酸酶活性的重复性限r与再现性R均呈良好的结果。本试验同时也建立了关于样品确证的方法以排除检测结果假阳性的可能,也进行了与农业行业标准NY/T801-2004的对比,结果表明本方法更灵敏、快捷、准确。乳过氧化物酶活性检测方法的评估:本方法对成熟的商品化试剂盒(Evergreen TERA~(TM))进行评估,结果表明:该方法检出限可低至2.83U/L,在0-400 U/L范围内有着良好的回归关系,R~2达到0.998,。加标回收率范围可达99.2%~108.1%,相对标准偏差范围4.5%~17.2%,说明该试剂盒有很好的准确性。此外,检测时不同的基质对检测结果也不会产生影响,但是样品保存时间过长会使得检测结果偏低。碱性磷酸酶和乳过氧化物酶活性检测方法的应用:本试验对不同热处理下巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶和乳过氧化物酶活性的变化进行探究,同时也对市售巴氏杀菌乳中两种酶活性进行检测,进而对国内巴氏杀菌工艺做出评价。结果表明:随着热处理温度升高,巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶和乳过氧化物酶活性温度会降低;其中,碱性磷酸酶失活条件为72℃15s,乳过氧化物酶失活条件为75-80℃15s;市售巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶普遍为阴性,大部分样品中乳过氧化物酶都失活,只有少数样品可以检测到活性,说明我国乳品巴氏杀菌工艺存在过度热处理、热加工等现象,仍需规范。
【图文】：

比色法,基本原理,荧光法

图 1.1 比色法的基本原理Figure 1.1 The principle of colorimetric method些比色法的研究使用了其他的底物。Aschaffenburg 等以对硝性磷酸酶作用下催化生成黄色的硝基酚，相较于苯酚法此方额外的培养时间[28]。Babson 等则利用酚酞单磷酸环己胺盐作测定反应生成的酚酞，此方法的优点是产物更为稳定[29]。比色一定的缺陷，如：反应操作繁琐，需要检测时间过长，检出限荧光法等第一次提出用荧光法测定牛碱性磷酸酶[30]。荧光法的原理磷酸酶的催化作用下生成强荧光物质，通过测定荧光吸光度来活性，经典的荧光法采用的底物有：4-甲基伞形酮磷酸酯，，素等。1990 年，Rocco 开发了以 2-(2-苯并咪唑基)-6-强本荧光法，此底物在 38℃下，由碱性磷酸酶催化生成强荧光物

化学结构,化学发光法,碱性磷酸酶

乳及乳制品中碱性磷酸酶和乳过氧化物酶比色法和荧光法，它的原理是测定底活性，目前化学发光法用到的底物是PPD），发光产物为 1,2-二氧环己烷酸酶检测物。发光法反应时间快，灵同的是，化学发光法也逐渐形成了一nces Inc.），Salter 联合多个实验室，效的检测巴氏杀菌乳中碱性磷酸酶推荐的测定乳品中碱性磷酸酶活性
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS252.7

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