淀粉分支酶在大肠杆菌中的非经典分泌研究

发布时间：2020-04-08 21:13

【摘要】：淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme,GBE)能水解淀粉分子中的α-1,4-糖苷键,然后合成α-1,6-糖苷键,从而提高淀粉的分支度,故在酶法改性淀粉中发挥着重要作用。据文献报道,绝大多数微生物来源的GBE都是胞内酶,而本实验室前期也分别构建了两种不同来源GBE(Gt-GBE和Ro-GBE)的大肠杆菌胞内表达系统,却意外发现它们能在不含信号肽的条件下分泌到培养基中。若能了解这两种GBE的无信号肽分泌机理,则可以为外源蛋白的分泌表达提供一种新的思路,同时也可以为促进GBE分泌表达的策略提供理论指导。因此,本文对这两种GBE的无信号肽分泌机理进行了研究,其主要研究结果如下:首先,对这两种GBE的无信号肽分泌现象进行了分析比较。通过测定酶活和蛋白电泳发现,它们在大肠杆菌中都可以大量分泌表达并不需要诱导剂,同时Gt-GBE的分泌速率要大于Ro-GBE。使用多个生物信息学网站对两种GBE进行分析,结果显示它们均为无信号肽的胞内蛋白,因此推测其分泌属于非经典分泌。为了考察这些无信号肽蛋白是否也会通过经典分泌途径进行分泌,对它们进行了亚细胞定位分析,发现它们的分泌都是“两步跨膜运输”,但并不属于“两步跨膜运输”中最主要的Sec途径。尽管Ro-GBE具有符合Tat途径特征的双精氨酸结构,但通过定点突变也排除了该分泌途径的可能。由于N端通常是影响蛋白分泌的关键因素,故通过将两种GBE的N端进行互换和截断,从而分析其N端与分泌的关系,结果发现N端不仅会影响它们的分泌还会影响它们的表达。其次,由于蛋白质分泌是一个跨膜运输的过程,因此细胞膜对分泌的影响也不可忽视。故以乳酸脱氢酶为指示物,测定发酵过程中大肠杆菌细胞膜的通透性,发现与含空载质粒的大肠杆菌相比,能分泌表达Gt-GBE和Ro-GBE的大肠杆菌细胞膜通透性更大,并通过流式细胞仪检测得到了一致的结果。由于大肠杆菌是具有两层细胞膜的革兰氏阴性菌,为了进一步分析两种GBE对其细胞膜的作用,分别测定了它们对细胞内膜和细胞外膜通透性的影响。结果均显示,非经典分泌蛋白Gt-GBE和Ro-GBE都会使大肠杆菌细胞内外膜通透性显著增加。然后,根据上述实验结果推测了GBE可能的非经典分泌模型,该模型指出GBE是通过提高大肠杆菌细胞膜通透性的方式分泌至培养基的。因此,尝试了加入几种能影响大肠杆菌细胞膜通透性的培养基添加剂,以期促进两种GBE的分泌。结果显示,甘氨酸和曲拉通X-100都可以显著促进GBE的分泌。而添加剂对两种GBE分泌的促进作用,进一步验证了上述模型的可靠性。综上所述,Gt-GBE和Ro-GBE在大肠杆菌内大量合成后,会引起细胞膜通透性的增大,从而以“两步跨膜运输”的方式分泌至培养基,这种分泌属于非经典分泌。同时N端对其分泌表达也有显著影响,并且可以通过加入添加剂促进其分泌。
【图文】：

家族,分支酶

1 绪论粉分支酶概述粉分支酶的结构分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme，简称 GBE)，是一种能水解合成 α-1,6-糖苷键的糖基转移酶[1]。由于糖原或淀粉等碳水化合物位置决定了它们的结构和功能[2,3]，因此无论是在微生物和动物体中，还是在植物体内的支链淀粉合成过程中，都发挥着重要的作表现出来的水解活性较低，但在反应机理上与淀粉水解酶相似，并酶的同源性较高，故被归类为糖苷水解酶(GH)家族。在早期的研究类为 GH13-8 亚家族和 GH13-9 亚家族中；然而在后期的研究中，属于 GH57 家族的 GBE[7]。这两种分别属于 GH13 和 GH57 家族的同，但经过趋同进化后，表现出了相近的催化特性，并与其它淀粉-葡聚糖的修饰和降解过程。

途径,周质空间,蛋白质,跨膜运输

图 1-2 I 型蛋白分泌系统[36]OM：外膜，P：肽聚糖层，IM：内膜Fig. 1-2 Type I protein secretion systemOM: Outer membrane, PG: Peptidoglycan, IM: Inner membrane II 型蛋白分泌途径大肠杆菌的 II 型蛋白分泌途径属于“两步跨膜运输”，蛋白质在分泌时先穿膜转运到周质空间，然后穿过细胞外膜分泌至细胞外。如图 1-3 所示，，蛋白步穿越细胞内膜时有三种途径可以利用，分别是 Sec 途径、Tat 途径和 SRP二步穿越细胞外膜时，大部分蛋白质依靠周质空间的非特异性渗漏，少部分是依靠 MTB 途径[37,38]。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.25

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