聚乙二醇定点修饰β-乳球蛋白谷氨酰胺残基对其致敏性的影响

发布时间：2020-04-18 15:45

【摘要】：β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)是牛奶中易引起过敏反应的主要成分之一,采用共价修饰降低其致敏性是国际乳制品加工的研究热点。本课题利用酶催化聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)定点修饰技术对β-LG进行修饰以降低其致敏性。在谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)的催化下,用5 kDa单甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH_2)对β-LG的谷氨酰胺残基(Gln)进行了修饰,制备得到了PEG单修饰产物,然后对修饰产物的结构、修饰位点和致敏性进行了分析,探究了酶催化PEG定点修饰β-LG的修饰位点、结构变化与致敏性之间的关系,并对其致敏性变化机理进行了初步探讨。首先,对β-乳球蛋白谷氨酰胺残基进行了PEG定点修饰并对修饰条件进行了优化。以β-LG的PEG修饰产物的修饰率为指标,通过SDS-PAGE结合凝胶过滤色谱分析对修饰条件进行了优化。结果表明,β-LG与PEG摩尔比、酶与底物质量比、反应温度、pH、乙醇添加量对修饰反应均有较大影响。其最佳修饰条件为:反应pH 7.0、反应温度25℃、β-LG与PEG摩尔比1:15、TGase与β-LG质量比3:1、缓冲液中乙醇添加量25%。在该修饰条件下其PEG修饰产物的修饰率可达到60.17%,且只有一种PEG修饰产物生成。采用阳离子交换色谱对β-LG的PEG修饰产物进行了分离纯化并对得到的修饰产物进行了鉴定。SDS-PAGE分析结果显示,纯化得到的PEG修饰产物仅有一个单一条带,其表观分子量在28 kDa左右;MALDI-TOF-MS测定结果表明,β-LG及其PEG修饰产物的实际分子量分别约为18.3 kDa和23.4 kDa,说明得到的修饰产物为只有一个PEG分子连接的PEG单修饰产物;RP-HPLC分析结果表明,得到的PEG修饰产物均一,无其它位置异构体存在。通过圆二色谱、内源荧光光谱、表面疏水性和自由巯基含量测定、修饰位点分析以及致敏性测定,研究了酶催化PEG定点修饰β-LG的修饰位点、结构变化与致敏性之间的关系。结构分析表明,经PEG修饰后,β-LG的二级结构未发生明显改变;其PEG修饰产物的内源荧光强度降低,表面疏水性增加,自由巯基含量无明显变化,说明经PEG修饰后β-LG的三、四级结构有轻微改变。PEG修饰位点分析显示,其修饰位点可能位于Gln155或Gln159。致敏性测定结果表明,PEG修饰可以使β-LG的致敏性显著降低69%。结合PEG修饰前后β-LG的结构和致敏性分析结果,推测TGase催化PEG定点修饰使β-LG的致敏性降低的机制主要是由于PEG链的空间屏蔽效应,连接在β-LG谷氨酰胺残基上的分子量较大的PEG长链覆盖在蛋白表面,掩盖了β-LG表面的部分线性抗原表位和构象表位,阻碍了它们与特异性抗体的结合,从而使致敏性降低。
【图文】：

白概述白（β-lactoglobulin，β-LG）是由猪、马等哺乳动物的乳特有蛋白，是乳清蛋白的主要成分[1]。牛奶中的蛋白乳清蛋白两种，其中，酪蛋白在牛乳蛋白中所占的比 20%为乳清蛋白，β-LG 在乳清蛋白中约占 43.6~50%在牛乳中的平均含量约为 2~3 g/L[2]。牛乳中β-LG 分子分子质量在 18.3 kDa 左右，等电点在 5.1 至 5.3 之间组成[1]。自然状态下的β-LG 一般以稳定的二聚体形式价键连接，当 pH 小于 3.5 或 pH 大于 7.5 时二聚体解五个半胱氨酸残基，分别形成了两个二硫键（Cys69）和一个自由巯基（Cys121）[3]。β-LG 的结构紧密，较多，占 43%左右，α-螺旋含量约为 10~15%，其余为图 1.1 所示，在中性 pH 时八条反向平行的β链经氢键，桶外还有一条具有三个转角的α-螺旋和一条β链[4]。

图 1.2 PEG定点修饰蛋白质N端的α-NH2[37]Fig. 1.2 PEGylation of proteins at N-terminal α-NH2Neulasta 是第一个利用N端PEG修饰技术修饰得到并成功投入市场的药物，它是用20 kDa的PEG-醛对粒细胞集落刺激因子的N端氨基进行修饰得到的。Dou等人[46]运用N端氨基的PEG定点修饰技术得到了单PEG化的猪胰岛素，他们发现在低pH、蛋白与PEG摩尔比 1:2 时PEG-醛对N端氨基的选择性更强，在该反应条件下PEG单修饰产物的产率约为 80%。Huang等人[47]用mPEG-丙醛对重组人成纤维细胞生长因子-2（rhFGF-2）进行修饰得到了PEG-rhFGF-2，结果表明，，PEG-rhFGF-2 在生物体内的免疫原性降低了 50%。Kinstler等人[48]在pH 5.0 的醋酸钠缓冲溶液中，用直链PEG对人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）进行修饰，其修饰产物的得率为 92%，通过修饰位点分析可知其修饰产物的修饰位点全部位于N末端的氨基上。除了上述研究外，应用N端PEG修饰技术对其它蛋白质类药物，如表皮生长因子（EGF）[49]、葡萄球菌激酶（Sak）[50]、重组人内皮细胞抑制素（rhES）[51]进行N末端定点修饰的研究也已经有所报道。（2） 巯基修饰
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS252.1

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本文编号：2632254