酶解芝麻蛋白肽及其亚铁螯合物的制备与特性

发布时间：2020-04-22 11:32

【摘要】：铁是人体必需的微量元素之一,铁缺乏会导致人体多种疾病。无机铁稳定性差,生物利用率低,有一定毒副作用,而蛋白肽亚铁螯合物可通过小肠直接吸收,吸收率高、安全无消化道刺激,无副作用,是一种理想的补铁剂。芝麻粕是芝麻榨油后的副产物,富含蛋白质等多种营养物质。我国芝麻粕资源丰富,但通常作为饲料或肥料使用,未能进一步综合利用,造成了资源的极大浪费。本文以芝麻粕为原料,探讨酶解芝麻蛋白肽及其亚铁螯合物的制备与特性,为新型铁补充剂的研发应用提供理论依据。对芝麻粕进行脱脂处理,采用碱式酸沉法提取芝麻蛋白。选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶对芝麻蛋白进行酶解,以水解度、亚铁离子螯合率和DPPH·清除率为指标,确定碱性蛋白酶为最佳酶源。采用碱性蛋白酶,对酶解的影响因素(酶解时间、底物浓度、加酶量、酶解温度、pH值)进行了单因素试验,在此基础上分别以亚铁离子螯合率和DPPH·清除率为指标进行响应面优化,结果表明:制备具有亚铁螯合活性芝麻蛋白肽的最佳酶解条件为:酶解时间3 h、底物浓度4.5%、加酶量1500 U/g、酶解温度45.5℃、pH 10。在此条件下,制备的芝麻蛋白肽亚铁离子螯合率为62.02%,DPPH·清除率为53.05%;制备具有抗氧化活性芝麻蛋白肽的最佳酶解条件为:酶解时间3 h、底物浓度4.2%、酶添加量1400 U/g、酶解温度为47℃、pH 10,在此条件下,制备的芝麻蛋白肽DPPH·清除率为55.42%,亚铁离子螯合率为55.09%。由于以亚铁离子螯合率为指标优化后的最佳酶解条件与以DPPH·清除率为指标优化后的酶解条件结果比较相近,而且在酶解芝麻蛋白肽亚铁螯合能力最高时其DPPH·清除率达到了 53.05%,与抗氧化活性肽最优酶解条件下的DPPH·清除率相近,因此确定芝麻蛋白最优酶解条件为:酶解时间3 h、底物浓度4.5%、酶添加量1500 U/g、酶解温度45.5℃、pH 10。将芝麻蛋白酶解液与氯化亚铁进行螯合,制备芝麻蛋白肽亚铁螯合物。通过单因素试验考察了 Vc与亚铁盐的质量比、肽与亚铁盐质量比、pH值、反应时间、反应温度和乙醇体积倍数对芝麻蛋白肽亚铁螯合物螯合率和产品得率的影响。根据单因素实验结果进行响应面实验,得到制备芝麻蛋白肽亚铁螯合物的最优工艺参数为:Vc与亚铁盐的质量比0.2:1、肽与亚铁盐质量比3:1、pH 7.41、时间17 min、温度32℃、乙醇添加量为反应液体积的6倍。在此条件下,螯合率和产品得率的理论值分别为72.42%、44.60%,在同样的条件下做验证实验,得到螯合率和产品得率分别为72.36%、44.68%,与理论值相近。以芝麻蛋白酶解液为原料,经超滤与离子交换层析两步分离得到亚铁螯合活性和抗氧化活性较高的芝麻蛋白肽。利用超滤法分离纯化芝麻蛋白肽,得到F1(10 kDa)、F2(3kDa-10 kDa)、F3(3kDa)三个组分,三个组分的亚铁离子螯合率和DPPH·清除率均存在显著性差异,组分F3的亚铁离子螯合率最高,为77.64%,其次是组分F2,为68.51%;组分F1的亚铁离子螯合率最低,为56.60%;组分F3的DPPH·清除率最高,为62.22%,其次是组分F2,为57.02%,组分F1的DPPH·清除率最低,为48.80%。组分F3再经离子交换层析分离得到三个组分:F3-1、F3-2及F3-3。三个组分的亚铁离子螯合率和DPPH·清除率均存在显著性差异,组分F3-2的亚铁离子螯合率最高,为84.82%,其次是组分F3-3,为76.63%,组分F3-1的亚铁离子螯合率最低,为64.64%;组分F3-1的DPPH·清除率最高,为67.98%,其次是组分F3-2,为63.22%,组分F3-3的DPPH·清除率最低,为58.05%。通过硫化钠法对芝麻蛋白肽亚铁螯合物的成分进行了定性研究,确定螯合物中不存在游离的蛋白肽,进而确定蛋白肽与亚铁离子已充分螯合;通过红外光谱分析对芝麻蛋白肽及其亚铁螯合物进行结构鉴定,确定螯合产物的生成,同时推测铁可能与肽结构的氨基、羰基和羧酸基团结合有关。氨基酸组分分析的结果显示芝麻蛋白肽螯合前后氨基酸比例发生变化,其中酸性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸与胱氨酸、组氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸含量增加,表明酸性氨基酸的羧基与氨基酸残基的吲哚基、咪唑基等活性基团对亚铁螯合能力起到了重要作用。在体外模拟胃肠道消化环境,考察芝麻蛋白肽亚铁螯合物的生物利用度。对比葡萄糖酸亚铁以及无机铁(FeSO4)的生物利用度,结果表明芝麻蛋白肽亚铁螯合物的生物利用度高于葡萄糖酸亚铁及FeSO4:胃中消化2 h后,Fe2+的释放率达90%以上;芝麻蛋白肽亚铁螯合物依赖于胃酸的酸化能缓慢释放Fe2+,对胃的刺激性弱于葡萄糖酸亚铁和无机铁;芝麻蛋白肽亚铁螯合物受pH影响小于葡萄糖酸亚铁和无机铁,稳定性较高;胃肠中消化8 h后芝麻蛋白肽亚铁螯合物的溶解度和透析率均在40%以上,溶解度和透过率均高于葡萄糖酸亚铁和FeSO4。
【图文】：

芝麻蛋白,水解度,蛋白酶

逦１５逡逑按２．３．４的方法酶解，得到不同蛋白酶对芝麻蛋白水解度的影响如图２－１所示。逡逑３（＞邋Ｉ＂邋＋中性蛋白酶逡逑一木瓜蛋白酶逡逑｜逦．逦Ｉ逦．逦Ｉ逦．逦Ｉ逦？逦Ｉ逦．逦Ｉ逦．ｉ．ｉ逡逑０逦１逦２逦３逦４逦５逦６逦７逡逑酶解时间（ｈ）逡逑图２－１不同蛋白酶对芝麻蛋白水解度的影响逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｐｒｏｔｅａｓｅ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｄｅｇｒｅｅ邋ｏｆ邋ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｓｅｓａｍｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑如图２－１所示，随着反应时间的延长，三种酶酶解芝麻蛋白的ＤＨ都在增大，０－４邋ｈ内ＤＨ逡逑随时间增加迅速，之后增速缓慢并趋于平缓。产生这种现象的原因主要有以下三点：（丨）在酶逡逑解反应初始阶段，蛋白酶的浓度较高，活性较好，可断裂的肽键数目多，因此，水解度上升逡逑最快；（２）随着酶解反应的进行，酶的浓度逐渐降低，活性也随之降低，酶的活性部位逐渐逡逑饱和；（３）酶解产物低分子量的蛋白肽对酶解反应具有较强的抑制作用，从而使反应速度变小逡逑并趋于平缓。同时，从图中可以看出，三种蛋白酶酶解芝麻蛋白的效果不同，其中碱性蛋白逡逑酶的酶解能力最强，其次是木瓜蛋白酶，中性蛋白酶酶解能力最差。有研究表明，碱性蛋白逡逑酶适合用来酶解碱提酸沉法制备的植物蛋白

等高线图,酶解时间,底物浓度,亚铁离子

Ｆｉｇ．邋２－９邋Ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｎｔｏｕｒ邋ｐｌｏｔｓ邋ｏｆ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ邋ｔｉｍｅ邋ａｎｄ邋ｓｕｂｓｔｒａｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ逡逑逦逦亚铁离子蝥合中逦逦逡逑：〔口逦．孑，逡逑Ｉ逦ｖ，＂逡逑Ｓ３邋＾邋邋逦逦逦一＾逡逑１２５０ｏｏＭＯｔ邋－ｔ＂７＾逦１邋邋逦１逦－￡：—ｉ邋，，逡逑ｃ：邋ｂｌｉＭｔ逦？曑、久故咖间逦１００逦，ｓｏ逦１００逦，Ｍ逦４ｔ＂逡逑５００邋００邋２邋００逡逑Ａ：邋？（＊？ｍｆ－＜ｉ逡逑图２－１０酶解时间和加酶量相互作用的响应面图和等高线图逡逑Ｆｉｇ．邋２－１０邋Ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｎｔｏｕｒ邋ｐｌｏｔｓ邋ｏｆ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ邋ｔｉｍｅ邋ａｎｄ邋ｅｎｚｙｍｅ逡逑ｌｏａｄｉｎｇ逡逑—邋．「ｐ逦亚铁离代合邋ｔ＾逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O641.4;TS201.2

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