基于分子印迹识别材料的三唑磷仿生免疫快速检测技术研究

发布时间：2020-04-27 22:04

【摘要】：三唑磷(Triazophos)是一种中毒、广谱有机磷杀虫剂,在谷物、水果和蔬菜上广泛使用。由于三唑磷化学稳定性好、半衰期长,使其在环境中极易残留,对环境和人类健康造成潜在危害。自2016年12月31日,我国明令禁止在蔬菜上使用三唑磷。目前三唑磷的检测技术主要有确证技术和免疫分析技术,但这些方法通常存在仪器昂贵、分析时间长、抗体制备困难等诸多缺陷。因此,设计合成具有特异性强、稳定性好、制备成本低的仿生识别材料,建立灵敏、简单、快速、稳定、廉价的检测方法具有重要的现实意义。基于以上背景,本文在合成分子印迹特异性识别材料基础上,开展了三唑磷分子印迹仿生酶联免疫、仿生荧光免疫及静电纺丝分子印迹膜层析技术的研究工作,具体如下:(1)以虚拟模板为设计理念,采用本体聚合和表面印迹法,获得了特异性识别能力好的分子印迹96孔阵列膜;合成三唑磷半抗原酶标记探针,建立了直接竞争仿生酶联免疫吸附检测方法,该方法线性范围为0.001~10000μg/L(R~2=0.9770),灵敏度(IC_(50))为428μg/L,检出限(LOD,IC_(15))为0.006μg/L。对该方法进行实用性评价,在甘蓝和苹果中分别添加三个水平三唑磷农药(10、50、500μg/kg),回收率为70.5%~119.8%,相对标准偏差为5.2%~19.7%。并用HPLC-MS/MS对结果进行验证,相关性良好(R~2=0.9927)。(2)通过酯键耦合技术,合成三唑磷半抗原CdSe/ZnS量子点标记探针,以制备的分子印迹96孔阵列膜为识别元件,经过条件优化,建立了基于分子印迹识别技术的CdSe/ZnS量子点仿生荧光免疫方法。结果表明,该方法线性范围为0.1~10000μg/L(R~2=0.9817),灵敏度(IC_(50))为3.63 mg/L,检出限(LOD,IC_(15))为0.31μg/L。在甘蓝和苹果中添加三个浓度的三唑磷农药(10、50、500μg/kg),其回收率为109.6%~118.9%,相对标准偏差为9.9%~19.5%,并与HPLC-MS/MS获得的结果相关性良好(R~2=0.9995)。与传统荧光猝灭方法相比,使用CdSe/ZnS量子点作为荧光标记探针的竞争检测方法显示出良好的灵敏度、稳定性、快速响应和抗干扰能力。(3)利用静电纺丝制膜技术,合成了纳米纤维与分子印迹微球杂化的复合纳米膜,制备了三唑磷半抗原-IgG-FITC荧光探针,初步研制了特异性识别三唑磷农药的纳米膜层析试纸条,建立了对三唑磷农药快速响应的检测新方法。试验筛选和优化了纺丝液(种类、溶剂、浓度)、电纺条件、表面活性剂、MIPs浓度、荧光探针浓度、竞争方式等技术参数和制备条件。结果表明:该方法三唑磷浓度在20~500μg/L范围内,具有好的线性相关性(R~2=0.9543),检出限为20μg/L。该方法解决了分子印迹作为仿生试纸条的识别元件存在的无法持久固定的技术瓶颈,拓宽了免疫层析试纸检测技术的应用范围,可为后续的研究提供新的思路。
【图文】：

流程图,孔板,印迹,流程图

实验用缓冲液：10 mM PBS（pH 7.4），配制方法：0.27 g KH2PO4、1.14 g 无水 Na2HPO4、 NaCl、0.2 g KCl，调节 pH 至 7.4，然后用超纯水定容至 1 L；洗板液：PBST（0.05%吐温 20M PBS（pH 7.4）；终止液：2 M H2SO4。.2.2 96 孔板表面分子印迹膜的制备在透明 96 孔板表面直接合成分子印迹膜，合成步骤如下：称取 588 mg（2 mmol）三唑酮50 ml 圆底烧瓶中，加入 20 ml 乙腈（制孔剂）溶解模板，然后加入 1020 μL（12 mmol）M功能单体），室温震摇 30 min。随后加入 1916 μL（6 mmol）TRIM（交联剂）和 50 mgAIBN（剂），继续震摇 60 min。最后向 96 孔板中每孔加入 100 μL 的预聚合液，用封口膜封住板表在每个孔上扎一个小洞（既便于抽真空又可避免溶剂挥发过快），在真空干燥箱中真空 37℃合反应 24 h。聚合完成后，用超纯水和甲醇分别洗板 3 次以除去未反应的溶液。随后将 96 孔板浸入装醇/乙酸（7:1, v/v）的大烧杯中，放入超声机超声洗脱模板，直至用 HPLC 检测不出洗脱液有模板，然后再放入甲醇中超声 4 h 除去乙酸。作为对照，非分子印迹膜按上述步骤合成只加入模板三唑酮。分子印迹膜制备流程如图 2.1（a）所示。

模板,功能单体,比例,吸附容量

院硕士学位论文第二章三唑磷分子印迹仿生酶联免疫吸附与讨论Ps 膜合成条件的优化IPs/NIPs 膜对三唑磷的吸附容量，对模板与功能单体的摩尔比及模板与交化。分别设置了几组不同的模板与功能单体比例（1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6）1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5）来合成分子印迹膜。结果见图 2.2（a）和图 2.2（b能单体比例为 1:6 时，印迹因子达到最大（1.17），同时当模板与交联剂比到最大（1.51）。(a)
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.3;TS207.53

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