芝麻香型白酒酿造过程乳酸菌定量以及代谢特征

发布时间：2020-05-03 14:38

【摘要】：白酒酿造系统中包含复杂的微生物菌群,由多种细菌、酵母菌、霉菌组成,其中乳酸菌群是主要的细菌分类,在发酵过程中扮演着重要角色。但是目前乳酸菌群在发酵过程中绝对含量的演替规律及其对风味物质的代谢功能还不清晰,解析乳酸菌群在发酵过程中绝对含量的演替规律和对风味物质的代谢功能为进一步定向调控白酒发酵菌群结构,改善酿造工艺,提升酿造品质提供有力理论依据。本研究针对目前高通量测序相对定量结果无法准确判定乳酸菌群演替规律的问题,以芝麻香型白酒酿造系统为研究对象,通过筛选天然内标,结合荧光定量PCR定量方法和扩增子测序技术,建立基于天然内标的细菌菌群绝对定量方法,揭示乳酸菌群绝对含量演替规律。根据乳酸菌群绝对含量的演替规律,结合多元统计和宏转录组学揭示乳酸菌群在不同发酵阶段中对风味物质的代谢贡献。本论文的主要研究结果如下:(1)为建立基于天然内标的细菌菌群绝对定量方法,本研究根据芝麻香型白酒发酵过程中细菌菌群的时间分布特征,以存在于所有时间点的样本中和平均相对丰度10%作为筛选天然内标微生物的条件,获得两种内标微生物:Lactobacillus sp.和Lactobacillus acetotolerans;设计内标微生物特异性引物PLsp和Place,构建基于荧光定量PCR的内标微生物绝对定量方法,该定量方法标准曲线的R~2大于0.99,定量限为17.9 copies/μL和10.7 copies/μL,Ct值的变异系数均小于1%,表明该方法灵敏度较高,重复性较好;与平板涂布计数比较,两者定量结果具有一致性(皮尔森相关系数=0.997,斜率=1.16)。分别以Lactobacillus sp.和Lactobacillus acetotolerans作为内标计算Weissella的绝对含量,基于两种不同内标微生物的计算结果具有一致性(皮尔森相关系数=0.98,斜率=1.08);统计十个白酒生产产区中两种天然内标微生物的分布特征,发现Lactobacillus acetotolerans分布在十个产区中,Lactobacillus sp.分布在八个产区中,表明该细菌菌群绝对定量方法具有广泛的适用范围。(2)本研究利用细菌菌群绝对定量方法揭示乳酸菌群绝对含量的演替特征,采用高通量测序方法分析芝麻香型白酒发酵过程乳酸菌群组成,包括Lactobacillus、Weissella、Leuconostoc和Pediococcus四个微生物属。采用基于内标的细菌菌群定量方法测定各乳酸菌属绝对含量,其中Lactobacillus和Weissella在发酵过程中绝对含量最多,均在发酵15天达到最高值,分别是7.67 Lg(copes/g)和6.62 Lg(copes/g),占总细菌含量的86.18%和7.77%。乳酸菌群绝对含量的演替规律分为两个阶段,第一阶段为生长期(发酵0到15天),总生物量逐渐上升,在发酵15天达到最高值(7.72 Lg(copes/g));第二阶段为稳定期(发酵15到46天),呈现缓慢下降的趋势,但总生物量维持在7.0 Lg(copes/g)以上。对比分析绝对定量结果与相对定量结果在乳酸菌生长趋势分析中的影响,结果显示相对定量对优势乳酸菌Lactobacillus的生长趋势描述影响较小(皮尔森相关系数=0.97),对其它非优势乳酸菌的生长趋势描述有误(皮尔森相关系数0.25);对比分析绝对定量结果与相对定量结果在描述乳酸菌群特征中的影响,结果显示绝对定量结果更能准确地观察到乳酸菌群差异。以上结果说明基于绝对含量更准确地揭示了乳酸菌群演替规律。(3)针对乳酸菌群对风味物质代谢贡献不清晰的问题,本研究利用多元统计和宏转录组学技术揭示乳酸菌群与风味物质之间的关系。选择16种核心风味物质作为研究对象,通过多元统计分析微生物-风味物质相关性网络发现9种核心风味物质与乳酸菌群相关。为进一步结合宏转录组学技术解析乳酸菌群在核心风味物质合成中的代谢特征。宏转录组测序选择发酵8天、15天和40天样本,共获得114.07 Gb高质量短序列,组装和去冗余后获得45567条unigenes,其中44381条unigenes注释到物种信息,活性乳酸菌组成以Lactobacillus、Weissella、Leuconostoc和Pediococcus为主。24377条unigenes注释到KEGG代谢通路,以Metabolism和Brite Hierarchies为主,在与风味物质合成有关的碳水化合物代谢途径和氨基酸代谢途径中,Lactobacillus和Weissella的unigene数量最多,在碳水化合物代谢途径的占比分别达到33.47%和14.45%,在氨基酸代谢途径分别达到24.60%和14.90%;与其它微生物相比,两者的乙酸、辛酸、癸酸、苯乙醇以及多种酯类化合物合成相关的基因转录丰度较高。
【图文】：

扩增子,通用引物PCR,测序,绝对定量

第三章结果与讨论第三章结果与讨论建立白酒酿造系统中乳酸菌群绝对定量方法本研究通过筛选芝麻香型白酒发酵过程中优势并普遍存在的细菌作为天然内，设计特异性引物，结合荧光定量 PCR 构建天然内标微生物的绝对定量方法于天然内标的细菌菌群绝对定量方法。酒醅样本 16S rRNA 高通量扩增子测序结果以入池发酵过程中 7 个时间点(每个时间点 3 个平行)的样本 DNA 为模板，通过A V3-V4 区通用引物进行 PCR 扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如，21 个样本扩增产物大小相同，无非特异性扩增条带，满足后续高通量扩增。

相对丰度,种核

通过比较 Lactobacillus acetotolerans 和 Lactobacillus sp.的相对丰度变化发现两者的相对丰度呈现负相关(皮尔森相关系数为 0.98，p<0.05)。Weissaramesenteroides 在发酵前期相对丰度较高，其中发酵 0 天时相对丰度最高(63.90%着发酵的进行，该菌的相对丰度逐渐下降，在发酵 40 天时相对丰度小于 1%，平均丰度为 17.10%。Pediococcus pentosaceus 在发酵过程中最高相对丰度为 16.7%，在 20 天之后的样本中相对丰度小于 1%，平均相对丰度为 2.43%。其它 6 个核心微生发酵过程中的样本相对丰度均较低， Bacillus coagulans 、 Leuconoseudomesenteroides 、 Lactobacillus plantarum 、 Lactobacillus fermentum 、 Acetobadonesiensis、Acinetobacter johnsonii 在整个发酵过程样本中的相对丰度均不大于 10综上所述，Lactobacillus sp.、Lactobacillus acetotolerans、Weissella paramesentero发酵过程中相对丰度>10%，且存在于所有时间点的样本中，可作为天然内标微生根据文献报道，部分白酒发酵系统[7]中未检测到 Weissella 或者相对含量较低，该属物将限制定量方法应用的普适性，另外，Lactobacillus 广泛分布在白酒酿造系统中据已有文献报道[4, 7-10, 12, 38]，Lactobacillus 属发酵中后期均成为优势微生物，因此actobacillus sp.和 Lactobacillus acetotolerans 是天然内标微生物的最佳候选。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS262.3

【参考文献】