大麦β-淀粉酶的异源表达

发布时间：2020-05-24 00:46

【摘要】：β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是一种重要的工业用酶。目前常用3-5二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS)法和对硝基苯酚麦芽戊糖苷(PNPβ-G3)法来测定β-淀粉酶的酶活力。其中DNS方法耗时,灵敏度低,测定的β-淀粉酶活力值会受到α-淀粉酶的影响,而大麦种子中往往含有较多的α-淀粉酶;PNPβ-G3法简便快速,灵敏度高,但是根据其测定结果不能准确有效地评估β-淀粉酶水解淀粉的能力。因此可以对两者测定方法进行线性拟合,从而准确有效地测定β-淀粉酶酶制剂中β-淀粉酶水解淀粉的能力。较高的热稳定性与催化活性有利于β-淀粉酶在工业上的应用,且微生物发酵生产更容易实现自动化控制。因此本研究首先对β-淀粉酶酶活力测定方法进行了改进及应用;并对大麦β-淀粉酶基因(amyB)进行了分子改造;最后将分子改造后大麦β-淀粉酶基因转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中进行异源表达。论文主要研究结果如下:1.β-淀粉酶酶活力测定方法的改进及应用:分别采用两种方法测定不同浓度的β-淀粉酶,然后将测定结果进行线性拟合,根据拟合曲线,可以由专一性底物法测得的吸光度结果换算出酶活力值。当β-淀粉酶浓度为12~60μg·mL~(-1)时,测定得到的β-淀粉酶酶活力结果线性相关系数较高,在此浓度范围测定结果的相对偏差小于10%。将该方法应用于β-淀粉酶产品的酶活力测定时,相对偏差小于10%。且通过该方法可以快速判断β-淀粉酶样品中是否混有其他淀粉水解酶类。2.通过10株不同大麦品种的氨基酸序列比对,推测位点R115和T387对酶催化性质和热稳定性有重要影响。对这两个位点进行定点突变,发现R115C的催化活性得到了增强,而T387A的热稳定性得到了提高,对T387位点进行饱和突变发现T387V具有最高的热稳定性。将R115C与T387V两个位点进行组合突变,得到的双突变大麦β-淀粉酶(amyBDM)最适温度、T50值、60°C半衰期与野生酶相比分别提高了5°C、3.6°C和29.5 min,其比酶活、K_(cat)/K_m值相比于野生酶分别提高了27.4%和54.7%。对其三维结构建模分析发现酶热稳定性升高的主要原因是蛋白质表面疏水性的增强与强氢键、盐桥数量的增加,酶催化能力增强的原因是活性中心氨基酸E378处氢键的变化。3.实现大麦β-淀粉酶在B.subtilis中的异源表达:成功构建重组枯草芽孢杆菌B.subtilis/pP43NMK-amyBDM。测得重组菌在发酵80 h时酶活达到434 U·mL~(-1),重组β-淀粉酶的比活力为864 U·mg~(-1),最适温度为60°C,在60°C下的半衰期比大麦β-淀粉酶提高了45.2%。重组β-淀粉酶的最适pH为5.0,在pH4.0环境中温浴1 h后仍具有84%的酶活。考察金属离子与抑制剂对重组β-淀粉酶的活性影响发现,大部分金属离子与抑制剂对酶的活性有抑制作用,DTT和1 mM的Li~(2+)、Na~+的存在对酶活性有小幅激活作用。大麦β-淀粉酶、商品β-淀粉酶和重组β-淀粉酶水解麦芽糊精生产麦芽糖的转化率分别为62.4%、55.1%和67.7%,将重组β-淀粉酶与普鲁兰酶联用后麦芽糖转化率可达85.5%。
【图文】：

图 1-1 β-淀粉酶在淀粉中的作用位点[13]Fig.1-1 The acting site of β-amylase on starch图1-2 β-淀粉酶的碳末端长环结构与淀粉结合区域Fig.1-2 SBD region and long ring structure of C-terminal of β-amyl的应用

[13]Fig.1-1 The acting site of β-amylase on starch图1-2 β-淀粉酶的碳末端长环结构与淀粉结合区域Fig.1-2 SBD region and long ring structure of C-terminal of β-amylase1.1.3 β-淀粉酶的应用β-淀粉酶广泛应用于淀粉加工业、发酵行业与医药行业。在酿造、饮料以及麦芽糖制造中，β-淀粉酶是重要的酶源，，其作为糖化剂有着十分重要的作用[18]。在淀粉加工业中，β-淀粉酶主要作用于各种大分子多糖物质，水解生成的物质主要是以麦芽糖为主。麦芽糖具有吸湿性低、抗结晶性优、热稳定性良好等特性，容易被人体消化吸收[19]。作为一种甜味剂，麦芽糖具有相对较低的甜度，广泛用于糖果、糕点、面包等食品的制作。中科院微生物研究所曾采用微生物 β-淀粉酶来生产高麦芽糖浆，并用其代替饴糖和蔗糖应用于面包、糖果的生产
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.25

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本文编号：2678206