意大利青霉中碳代谢抑制相关转录因子PiCreA功能研究

发布时间：2020-05-24 02:59

【摘要】：意大利青霉(Penicillium italicum)是柑橘果实重要的采后病原真菌,引发柑橘业严重的采后损失。目前的防治方法主要是化学农药,存在环境污染和食品安全风险。深入了解意大利青霉致病作用机制,将有助于新型安全高效的防控技术开发。研究表明,碳源利用对于病原真菌的生长发育和毒力至关重要,碳代谢抑制(CCR)是碳源利用的关键机制,主要由核心转录因子CreA调控。本实验研究了PiCreA在意大利青霉的生长发育、碳源利用和致病力中的作用。主要结果如下:1.从意大利青霉中克隆到一个编码丝状真菌CreA同源物的PicreA基因,其全长1236 bp,无内含子。PiCreA蛋白由411个氨基酸组成,含有转录因子特定的两个锌指结构域,部分高度保守的CreA氨基酸序列,以及一些与调控相关的特殊结构域。PiCreA在意大利青霉中进行CCR调控,并在不同碳源条件下表现出不同的表达模式。2.利用根癌农杆菌介导意大利青霉转化获得两株PicreA敲除突变株。结果表明,PiCreA的缺失导致意大利青霉生长发育和营养利用能力减弱。在各种碳源培养基中,PiCreA敲除菌株表现出普遍30~50%的生长受损,但除孢子萌发推迟外,分生孢子、芽管及气生菌丝均无明显变化。在果胶诱导条件下,PiCreA敲除菌株中果胶酶基因表达被下调。意大利青霉接种柑橘果实,无论何种接种方式(孢子或菌丝),缺失PiCreA后意大利青霉的毒力几乎完全丧失。3.利用RNA-seq技术,初步明确了PiCreA影响意大利青霉毒力的一些因素,包括?PicreA突变体可能诱导的植物抗性反应如次生代谢产物苯丙烷类物质、萜类物质转录上调,茉莉酸、乙烯信号传导途径激活和活性氧爆发减少,以及?PicreA缺失可能影响意大利青霉能量代谢和侵染过程中细胞壁降解酶活性。这些结果表明,PiCreA不仅调控意大利青霉的碳代谢抑制机制,而且在营养利用,毒力等方面发挥重要作用。上述结果为研究意大利青霉的碳代谢途径及进一步揭示意大利青霉与柑橘互作的分子机制奠定基础。
【图文】：

意大利青霉中碳代谢抑制相关转录因子 PiCreA 功能研究1.2.4.2 穿梭重组质粒的构建利 用 Sac Ⅰ / BamH Ⅰ 限 制 性 内 切 酶 分 别 对 敲 除 盒 片 段 和 穿 梭 质 粒pCAMBIA3300 进行酶切，胶回收试剂盒纯化回收后，利用 T4连接酶将重组片段与质粒连接，并转化大肠杆菌 DH5α 中，，培养于 LB 培养基（含有 50μg/mL 卡那霉素）。挑选并验证长出的单菌落，验证正确后测序。将正确的重组质粒转化根癌农杆菌AGL1。载体构建示意图见图 2-1。

M. 2000 bp Marker；1. CreA2-F/R 扩增产物。Fig.2-1Amplification of degenerate primers CreA2-F/RM.2000bp Marker; 1.Amplification of CreA2-F/R..2 PicreA 基因的生物信息学分析2.1 PicreA 基因序列分析利用 DNAMAN 将 PicreA 基因序列拼接起来，结果显示，PicreA 基因序A 开放阅读框（open reading frame, ORF）为 1236 bp 长，并编码一个 411的蛋白质。将获得的 PiCreA 氨基酸序列与其他四种真菌（Byssochctabilis、Penicillium polonicum、Talaromyces atroroseus、Helicocarpus griseusA 蛋白序列及 Saccharomyces cerevisiae 的 Mig1 蛋白序列进行比对，部分比图 2-2 所示。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS255.1

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本文编号：2678350