连翘花黄色素的提取及其对秀丽隐杆线虫应激抗性的影响

发布时间：2020-05-25 13:05

【摘要】：食品色素是一种食品添加剂,包括合成色素和天然来源色素两大类。尽管化学合成色素生产过程简单且廉价,但随着合成色素使用量的增长,安全问题逐渐引起人们的注意。由于天然色素来源于自然界,不仅对人体无毒无害,有些还具有一定的营养价值。因此,开发无毒无害的天然色素已成为当前的一大市场需求。木犀科连翘属植物连翘(Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl)是一种使用广泛的传统中药,每年早春时先叶开花,开花期长,花量大,颜色鲜黄且色泽持久,非常具有开发出天然色素的潜力。本文从连翘花中提取了连翘花黄色素(forsythia flower yellow pigment,FFYP)研究了其体内外抗氧化性,并以秀丽隐杆线虫为模型,研究其对线虫应激抗性的影响,期望开发出一种具有生物活性的天然食品色素。本文主要通过以下几个内容展开:1.FFYP制备工艺的优化及成分鉴定。通过单因素提取实验和正交实验优化了FFYP的最佳提取方法,最后得到FFYP提取的最佳条件组合是:乙醇浓度95%,提取温度50℃,料液比1:100(g:mL)。主要成分及含量通过高效液相色谱法检测,结果表明本研究中所制备的FFYP中含有芦丁236.1 mg/g,连翘酯苷A 116.9 mg/g,松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷82.5 mg/g和连翘苷18.2 mg/g。2.FFYP在不同pH、金属离子、温度、光照、氧化剂和还原剂影响下稳定性的研究。实验结果显示,FFYP在弱酸弱碱环境下稳定性良好;金属离子对其稳定性影响不大;阳光直射时FFYP较不稳定,避光或室内自然光下稳定性较好,且其稳定性不受紫外线的影响;FFYP温度较低时稳定性很好,在高温加热时保存率有些降低,但80℃处理1小时其保存率仍能保持在80%以上;还原剂不能降低FFYP的保存率,但是氧化剂处理会降低其保存率。3.FFYP的细胞内外抗氧化活性检测。通过化学反应的方法检测FFYP的细胞外抗氧化活性,实验结果表明,FFYP具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力和铁离子还原能力,且在浓度为0~0.1 mg/mL内具有浓度依赖性。使用细胞内抗氧化活性(Cellular Antioxidant Activity,CAA)法检测FFYP在HepG2细胞内的抗氧化活性。实验结果也表明FFYP在细胞内可剂量依赖性地显示出活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)清除能力。4.以秀丽隐杆线虫为模型,研究了FFYP对线虫氧化应激抗性的影响,并初步探究了其作用机制。FFYP对线虫氧化应激抵抗力的影响实验结果表明,20,40,80μg/mL的FFYP均能提高线虫氧化应激抵抗力,其中40μg/mL效果最明显。线虫体内ROS含量和抗氧化系统活性检测结果显示:FFYP能够显著降低线虫体内ROS含量,并提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,增加还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,表明FFYP增强线虫对氧化应激抗性是通过提高线虫体内抗氧化防御系统活性而得到的。使用突变体线虫和qRT-PCR实验初步探索FFYP提高线虫氧化应激抵抗力的机制,结果显示:FFYP无法延长Skn-1突变体线虫在氧化应激下的寿命,Daf-16和Hsf-1突变体线虫寿命可被延长,但延长率低于野生型N2线虫。qRT-PCR实验也显示,FFYP作用后,Daf-16、Skn-1和Hsf-1靶基因的表达量均被提高。表明FFYP通过Daf-16、Skn-1和Hsf-1的共同作用来提高线虫对氧化应激的抵抗力。总之,本文提取分离得到的FFYP不仅性质稳定,在细胞内外均具有较好的抗氧化性,作用于秀丽隐杆线虫还能提高线虫氧化应激抵抗力。表明FFYP有抗氧化和抗应激的能力,这为日后对连翘花的开发和应用研究奠定理论基础。
【图文】：

示意图,类胰岛素,信号通路,胰岛素

图 1.1 胰岛素/类胰岛素信号通路示意图DAF-16 是 IIS 通路的主要转录因子，线虫中的 DAF-16 属于叉头蛋白（Forkheox protein，FOXO）家族与哺乳动物的 FOXO3 同源，是许多物种生长、生命调节胞凋亡和应激反应的重要调控因子[58-62]。正常生理状态下，DAF-16 活性较低，刺激以后 DAF-16 蛋白入核调节其靶基因的表达，可以上调许多应激应答相关蛋因的表达，如 Sod, Gsh-px, Ctl-1, Ctl-2[62]。daf-2 突变表型可被 daf-16 突变抑制明 daf-16 受 daf-2 信号传导负调控，并且是 daf-2 主要的下游效应子。DAF-16 af-2 信号被废除时转移到细胞核并调节转录。多个 daf-16 转录靶标可能介导 IIS 的多种功能。除了 DAF-16 外，HSF-1和SKN-1也受 IIS 通路调控，它们相互参与彼此的和调节或者相互协助彼此调控靶基因。HSF-1是一种热休克蛋白（Heat shock proteSP）转录因子，主要负责调节热应激诱导基因的转录表达。从受体DAF-2开始，I径由链式磷酸化组成，在正常条件下，其保持DAF-16和HSF-1在细胞质中分布

单因素实验,连翘花

图 2.1 FFYP 提取的单因素实验1 Single factor experiment of extracting of FFYP Single factor experiments showimal ethanol concentration was 95% (A) when FFYP was extracted, the optimum tem °C (B), and the optimum ratio of material to liquid was 1:100(g:mL) (C).连翘花黄色素的正交提取在单因素实验选择出的最佳条件附近选取 3 个水平，设计三因素三水平如表 2.1），确定 FFYP 的最佳提取条件。正交实验一般使用单因素实验前后选取 3 个水平进行，由于工业提取很少用无水乙醇进行提取，因此的乙醇浓度最大到 95%，考虑到 95%乙醇的沸点，本实验选取的最高温为节约资源，对料液比的选择不超过 1:100(g:mL)。如表 2.2 所示，比较，RA>RC>RB，即这三个因素对 FFYP 的提取效率的影响大小顺序依次度>料液比>温度。最后得到 FFYP 提取的最佳条件组合是乙醇浓度 95% 50℃，，料液比 1:100 (g:mL)。取一定重量的连翘花粉末，以最佳提取条
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS264.4

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