豆类胰蛋白酶抑制剂对鱼类MBSP的作用机理研究

发布时间：2020-05-26 04:33

【摘要】：鱼糜制品生产是鱼类高附加值利用的重要途径之一。有研究表明,肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)是导致鱼糜出现凝胶劣化现象的关键酶,但在鱼糜制品加工过程中尚未有有效手段阻止MBSP的作用。豆类中富含胰蛋白酶抑制剂且食用安全性高。因此,本研究从大豆、绿豆及黑豆中制备天然胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor,TI),同时对重组鲫鱼MBSP进行了高效表达,之后探讨了三种豆类胰蛋白酶抑制剂与重组鲫鱼MBSP的体外作用关系及其对鱼糜品质的提升效果,以期为鱼糜加工中凝胶劣化的有效控制提供理论参考。通过硫酸消解、热处理沉淀、调节pH沉淀、硫酸铵盐析及柱层析等生化分离技术,获得了高纯度的大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor,STI)、绿豆胰蛋白酶抑制剂(mung bean trypsin inhibitor,MBTI)以及黑豆胰蛋白酶抑制剂(black soybean trypsin inhibitor,BSTI)。性质分析表明,STI、MBTI及BSTI均表现出良好的pH稳定性,三者在pH 2-11的范围内稳定;STI与BSTI在60℃下呈现较高抑制活性,而MBTI甚至在90℃下还有良好的稳定性。金属离子对TI抑制活性的影响显示,Fe~(2+)能使STI、MBTI、BSTI的活性显著下降。圆二色谱分析发现,STI含有β-折叠40.6%,β-转角21.7%,无规则卷曲31.3%,α-螺旋7.8%;MBTI含有β-折叠69.6%,β-转角8.6%,无规则卷曲22.3%,α-螺旋2.2%;BSTI含有β-折叠43.4%,β-转角21.2%,无规则卷曲29.0%,α-螺旋8.1%。通过扫描不同温度下STI、MBTI及BSTI的二级结构变化,得出三者变性温度分别为64±0.1℃、91±0.6℃与61±0.9℃。利用荧光底物Boc-Gln-Arg-Arg-MCA分析了STI、MBTI及BSTI对MBSP的抑制效果与抑制动力学。结果表明,STI、MBTI及BSTI均能对MBSP产生抑制作用,其中STI与MBTI对MBSP的抑制类型为竞争性抑制,而BSTI为非竞争性抑制。经计算,三者的抑制常数K_i分别为0.32 nmol/mL、0.077 nmol/mL和1.42 nmol/mL。STI、MBTI与BSTI对MBSP表现出了较高的亲和性,蛋白质互作分析表明三种豆类抑制剂与MBSP的亲和常数K_D分别为1.07×10~-77 mol/L,1.257×10~-88 mol/L,1.797×10~-77 mol/L。MBSP在55℃下能够对肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)产生强烈分解。本研究结果表明,终浓度为1μg/mL的STI、MBTI及BSTI均能有效抑制因MBSP作用而引起的MHC降解。同时,进一步分析了三种豆类抑制剂对鱼糜品质的影响,结果发现,STI、MBTI与BSTI能在一定程度上提升鱼糜的凝胶强度。模拟胃肠液消化的结果显示,在0.1%的添加量下的三种豆类胰蛋白酶抑制剂对鱼糜的消化特性没有不良影响。综上所述,三种豆类胰蛋白酶抑制剂均能对MBSP产生抑制,并在一定程度上改善因MBSP导致的鱼糜凝胶劣化,提升鱼糜的品质,表明其在鱼糜加工中具有良好的应用前景。
【图文】：

氨基酸序列,胰蛋白酶抑制剂

]。根据氨基酸序列排布及蛋白z 型与 Bowman-Birk 型胰蛋白 inhibitor, KTI）的分子量通常形成 2 对二硫键，因此热稳定TI 只能结合一分子对应的靶）。而 Bowman-Birk 型胰蛋白 Birk 于 1985 年在大豆种子中小，多为 8-10 kDa，同时结构有两个对称的环状结构区，每分子比 1：2 的形式结合蛋白[56-58]。相比 KTI，BBI 具有更域中更加受到研究者的青睐。且越来越多的证据表明，每

胰蛋白酶抑制剂,分子比,结合蛋白

分子比 1：2 的形式结合蛋白酶）[56-58]。相比 KTI，，BBI 具有更域中更加受到研究者的青睐。并且越来越多的证据表明，每种图 1-1 Kuntiz 型胰蛋白酶抑制剂的结1-1 The structure of Kunitz-type trypsin
【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS254.4

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