鸡蛋高密度脂蛋白对脂质代谢的影响及机制研究

发布时间：2020-06-01 11:12

【摘要】：鸡蛋高密度脂蛋白(EYHDL),又叫做卵黄脂磷蛋白,是蛋黄(EY)中第二大类脂蛋白,其具有高磷脂、降血压的特点,是潜在的脂质代谢调节因子。本课题以EYHDL为研究对象,首先从鸡蛋EY分离制备高纯度EYHDL,并对其结构及脂质组成进行表征;利用小鼠营养干预实验,研究EYHDL对小鼠脂质代谢影响;通过对小鼠血清及肝脏脂质组进行系统分析,探究EYHDL对脂质代谢的可能作用;结合体外细胞实验,对细胞脂质及代谢物进行系统分析,找寻EYHDL调控脂质代谢的相关通路;最后开展体外细胞实验对其调控代谢通路进一步验证。主要研究内容和结果如下:(1)建立了一种双水相提取EYHDL的方法,比较了NaCl和(NH_4)_2SO_4两种盐溶液对EYHDL粗品纯度和提取率的影响,结果表明利用NaCl结合PEG的方法可制备纯度较高的EYHDL,在pH 4.5,聚乙二醇(PEG6000)添加量为4%时其纯度(83.0%)和提取率(73.7%)最高。此方法不仅简化了步骤,而且环保高效。利用DEAE-650M阴离子柱实现了EYHDL的高效纯化,随后对纯化后EYHDL的粒径和二级结构分析,发现其粒径在10-20 nm左右,且其蛋白的二级结构以α-螺旋和β-转角为主,表明此方法得到了结构稳定的EYHDL。(2)利用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)和气相质谱(GC-MS)分析了EYHDL的脂质组分。结果表明,磷脂酰胆碱(PC)为EYHDL中含量最高的脂质组分,与EY相比,其甘油三脂(TG)的含量约为EY的1/4,其含有较高水平的脂酰胆碱(PC),磷脂酰肌醇(PI)和甘油二酯(DG)(p0.05)。差异脂质比较结果表明,在ES+模式下,一共检测到22种TG差异脂质,其在EYHDL中的含量均显著低于EY(p0.01)。在ES-模式中,一共检测到30种差异脂质,包括10种P-胆碱类(9种PC,1种溶血磷脂酰胆碱(LPC)),15种P-乙醇胺类(3种磷脂酰乙醇胺(PE),2种溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)),4种PI和1种鞘磷脂(SM)。相比于EY,EYHDL大多数PC和PE差异脂质显著提高(p0.01)。此外,GC-MS结果显示,EYHDL较EY含有更高水平的C18:1和C22:6,以及更低水平的C16:0(p0.05)。(3)建立为期100天的高脂诱导代谢综合征(MetS)小鼠模型,研究EYHDL对血脂相关指标以及与脂代谢有关基因表达的影响。结果显示,相比高脂(HFD)对照组,EYHDL摄入显著抑制了小鼠体重增加和腹部脂肪组织积累,同时降低了血清低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和TG浓度,以及肝脏TG和总胆固醇(TC)(p0.05)。此外,EYHDL摄入也增加了小鼠TC排泄量,减轻了脂肪肝病症,改善了葡萄糖和胰岛素耐受性。并对HFD组小鼠肝甾醇调节元件结合蛋-1c(SREBP-1c),乙酰辅酶A羧化酶1(ACACA),脂肪酸合成酶(Fasn),甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)等相关基因的上调产生抑制作用。(4)利用GC-MS分析血清、肝脏和粪便中脂肪酸(FA)种类及含量的变化。结果表明,与HFD组相比,EYHDL可显著降低小鼠血清中总脂肪酸(∑FA)和饱和脂肪酸(SFA)如C18:0和C16:0水平,以及肝脏中SFA(C14:0和C12:0)、单不饱和脂肪酸MUFA,C16:1、C16:0和C18:1和多不饱和脂肪酸PUFA,C18:3和C18:2水平(p0.05),并促进PUFA如C18:2和C20:3的外排。随后利用UPLC-MS/MS对60天和100天小鼠血清和肝脏脂质组进一步分析。与HFD相比,EYHDL可显著降低血清中PC、FA和TG,并显著提高肝脏中PI和SM(p0.05)。随后利用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)找寻差异脂质,在血清中一共检测到10种脂质标志物,其中5种PI,PI(16:0/18:2),PI(16:0/20:4),PI(18:0/20:3),PI(18:0/20:4)和PI(18:1/20:4)显著下调(p0.01)。肝脏中一共检测到8种下调DG,DG(16:0/18:2),DG(18:1/18:2),DG(18:1/20:4),DG(18:2/18:2),DG(18:2/20:4),DG(18:2/22:6),DG(18:3/18:2),和DG(22:5/18:2),2种下调TG(TG(18:1/20:3/22:6),TG(18:1/22:5/22:6)和3种下调的FA(C20:4,C20:5和C22:6)(p0.01),通过代谢通路分析,得出差异脂质涉及到的主要代谢通路为甘油磷脂代谢。(5)建立了体外油酸(OA)诱导HepG2细胞脂肪肝模型,探究EYHDL对于脂肪肝形成的调控机制。结果表明,EYHDL可显著抑制肝细胞内TG脂滴的积累,同时提高细胞内LPE及磷脂酰丝氨酸(PS)含量(p0.05)。差异脂质结果表明,相比于OA对照组,EYHDL可显著降低TG,并显著提高与脂肪肝形成负相关的LPC、酰基肉碱(CAR)及神经酰胺类(Cer)等物质(p0.05),代谢通路分析也证实甘油磷脂代谢是最为相关的代谢路径。此外,利用ESI-QTRAP-MS/MS对下游代谢物分析,在正负离子模式下分别检测到297和230种代谢物。与OA对照组相比,一共鉴定到9种差异代谢物,分别是7种卵磷脂类(LPE 16:0,LPA 16:0,LPC 16:0,LPC18:0,LPC 20:2,LPC 17:0和LPC 18:3),1种甘油磷酸酯(Glycerol 3-phosphate)和1种脂质(PAF C-16),其中所有检测到的差异代谢物均在OA+EYHDL组中显著下调(p0.01)。对代谢通路进行分析,其中甘油磷脂代谢和胆碱代谢是最相关代谢。因此,脂质组和代谢组相关路径分析均表明EYHDL作用机制与甘油磷脂代谢有关,与小鼠实验得到的相关代谢通路相互印证。(6)对甘油磷脂代谢路径进一步验证,长链脂肪酸(LCFA)作为甘油磷脂代谢的原料,其转运吸收异常可造成甘油磷脂代谢紊乱。因此,建立Caco-2和HepG2共培养体系,以评估EYHDL对于6种长链脂肪酸C14:0,C16:0,C16:1,C18:0,C18:1,C18:2转运动态吸收的影响。结果表明,EYHDL可抑制C16:1和C18:2从Caco-2单层膜AP端相BL端的转运,并抑制C16:0、C18:0和C18:1在HepG2细胞中积累,进一步降低TG油滴的积累。对LCFA转运相关蛋白进行Western-blot和RT-qPCR分析,结果表明,EYHDL通过抑制Caco-2脂肪酸转运蛋白2(FATP2)和脂肪酸结合蛋白pm(FABPpm)从而抑制C16:1和C18:2的转运。同时还降低HepG2细胞SREBP-1c及其下游脂肪生成基因ACACA和SCD1的表达,抑制LCFA在肝组织中合成TG。
【图文】：

SDS-PAGE凝胶电泳,高密度脂蛋白,载脂蛋白,蛋黄

3 及卵黄的 SDS-PAGE 凝胶电泳图。Std, 标准分子量；y, 蛋黄高密度脂蛋白（Huopalahti et al 2007）PAGE gel electrophoresis of EYHDLand egg yolk. Std, standght; y, egg yolk; HDL, high density lipoprotein from egg yolk个单体是 5 个主要的载脂蛋白组成，分子量范围为 3的含量分别是：110kDa：21%、100kDa：16%、80k

母鸡,血清,卵母细胞,颗粒

首次揭示 apoA-I 是 EYHDL 中主要的蛋白质。更重要的是，apoA-I 是良好脂蛋白颗粒中的重要组分：它在 EYHDL 中定位及其它的一些结果，都强烈的寓示着EYHDL，至少大部分，都来自于鸡血清。免疫电镜表明 EYHDL 颗粒与 VLDL 颗粒并不共区域化，这些研究都表明EYHDL颗粒是从母鸡的血清中吸收到卵母细胞中，然后通过不同于其它脂蛋白的吸收方式沉积在 EY 中。而雌性激素对鸡的 EYHDL的脂质和脂蛋白组成有影响，母鸡或者雌性化的公鸡拥有载脂蛋白 A-I（IapoA-II），并富含 TG。EYHDL 从卵母细胞到 EY 的机制与 EYLDL 不同。Shen 等表明 EYHDL 来源于血清中的 HDL，，通过卵母细胞的内吞作用进行吸收。为了进一步支持这一观点，Vieira 等分别从公、母鸡血清以及 EY 血清中分析了三种不同包裹网格蛋白的 EYHDL（见图 1-3）（Vieira et al 1995）。发现这三种制备物均为球形颗粒，平均粒径近 10nm，与典型哺乳动物的 EYHDL 颗粒类似。采用免疫电镜分析金标记的 apoA-I 来定位 EYHDL 颗粒。EYHDL 集中位于电子致密颗粒中，这个结构被认为含有大部分的 EYHDL（见图 1-4）（Shen et al 1993）。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS253.1

【参考文献】