靶向金葡菌Stp1天然抑菌剂筛选及作用机制分析

发布时间：2020-07-04 05:47

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称“金葡菌”)是引起食源性疾病的常见病原菌之一,对食品安全及人类健康产生严重威胁。此外,金葡菌还可以引起感染,造成皮肤和软组织损伤,甚至引起败血症、肺炎等。金葡菌能够产生多种毒力因子是导致食源性疾病和感染的主要原因。金葡菌的真核样丝氨酸/苏氨酸磷酸酯酶(eukaryotic-like Ser/Thr phosphatases,Stp1)能够调控多种毒力因子的分泌和表达,且可参与到许多重要的通路中,是金葡菌致病力发挥的重要蛋白分子。因此以Stp1作为抑菌剂的作用靶点来降低金葡菌的致病能力,是解决随着抗生素滥用而产生的金葡菌耐药性难题的可行策略。本论文构建了PET-28a-Stp1原核表达质粒,获得了高纯度的Stp1重组蛋白。筛选了多种靶向Stp1的天然抑菌剂,测定了连翘酯苷A、迷迭香酸、氯化矢车菊素对Stp1的半抑制浓度(IC_(50))。通过分子对接、分子动力学模拟、结合自由能计算及分解分析了Stp1与连翘酯苷A、迷迭香酸、氯化矢车菊素的作用机制。通过突变子分子动力学模拟、突变子结合自由能计算、定点突变试验、磷酸酯酶活性试验和荧光淬灭试验验证了三种天然抑菌剂与Stp1的作用机制。具体研究结果如下:(1)筛选了18种可直接与Stp1相互作用的天然抑菌剂,其中迷迭香酸、连翘酯苷A和氯化矢车菊素对Stp1抑制效果最明显(2)连翘酯苷A对Stp1的IC_(50)为2.38μg/mL。连翘酯苷A是竞争性抑制剂,主要通过氢键和疏水相互作用结合在Stp1的活性区域,直接影响Stp1的活性,且结合的关键氨基酸残基为Phe156、Thr157、Arg161、Tyr199、Asn229、His230、Lys232和Asp233。相比于野生型Stp1,连翘酯苷A与Stp1突变子F156A、R161A和D233A的结合区域和结合方式没有发生改变,抑制作用降低,结合力下降,表明Phe156、Arg161和Asp233是连翘酯苷A与Stp1结合的关键氨基酸残基,验证了连翘酯苷A抑制Stp1活性的机制为竞争性抑制。(3)迷迭香酸对Stp1的IC_(50)为0.91μg/mL。迷迭香酸是竞争性抑制剂,主要通过氢键和疏水相互作用结合在Stp1的活性区域,直接影响Stp1的活性,且结合的关键氨基酸残基为Arg14、Met39、Gly40、Lys43和Lys232。相比于野生型Stp1,迷迭香酸与Stp1突变子R14A、G40A和K232A的结合区域和结合方式没有发生改变,抑制作用降低,结合力下降,表明Arg14、Gly40和Lys232是迷迭香酸与Stp1结合的关键氨基酸残基,验证了迷迭香酸抑制Stp1活性的机制为竞争性抑制。(4)氯化矢车菊素对Stp1的IC_(50)为14.59μg/mL。氯化矢车菊素是竞争性抑制剂,主要通过氢键和疏水相互作用结合在Stp1的活性区域,直接影响Stp1的活性,且结合的关键氨基酸残基为Asp194、Asp198、Tyr199、Ala226、Asp228和His230。相比于野生型Stp1,氯化矢车菊素与Stp1突变子D198A和H230A的结合区域和结合方式没有发生改变,抑制作用降低,结合力下降,表明Asp198和His230是氯化矢车菊素与Stp1结合的关键氨基酸残基,验证了氯化矢车菊素抑制Stp1活性的机制为竞争性抑制。本论文不仅筛选18种可直接与Stp1相互作用的天然抑菌剂,而且分析了迷迭香酸、连翘酯苷A、氯化矢车菊素抑制Stp1的机制,这将为以Stp1为靶点的天然抑菌剂开发和迷迭香酸、连翘酯苷A、氯化矢车菊素应用于食品工业和制药工业提供理论参考。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS202.3
【图文】：

论-Stp1 重组表达质粒的构建过以金葡菌 USA300 基因组为模板的 PCR 扩CR 扩增产物进行分析，结果如图 2.1，stp1 基对 PCR 扩增产物和 PET-28a 进行双酶切，将酶 重组质粒。质粒转入 DH5α，挑取单菌落接种 PCR 鉴定，鉴定结果如图 2.2，阳性菌液可扩，阴性菌液未见有 PCR 产物。提取阳性菌液的切鉴定，鉴定结果如图 2.3，用琼脂糖凝胶电tp1 基因。将两次鉴定结果均为阳性的质粒测序比对后同源性为 100%的质粒进行后续实验。

图 2.2 菌液 PCR 鉴定电泳图1：空白载体菌落 PCR；2 和 3：重组载体菌落Fig 2.2Agarose gel electrophoresis of colony PCony PCR of blank vector; 2: Colony PCR of recom

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本文编号：2740733