牛乳铁蛋白的铜锌增补对其免疫及抗炎活性影响作用研究

发布时间：2020-07-06 09:58

【摘要】：乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)作为一种铁结合糖蛋白,具有抗菌、抗癌、抗炎以及免疫活性,其生物学作用日益被关注。牛乳铁蛋白作为一种食物来源的蛋白质,可商业化生产并用作食品营养添加剂,有利于消费者机体健康。许多微量元素具有重要生物功能,在免疫系统中也发挥重要作用,提高机体的免疫功能。然而,尚未确定微量元素增补对乳铁蛋白的免疫和抗炎活性是否有影响作用。为此,本课题将牛乳铁蛋白分别增补铜/锌0.16、0.32和0.64mg/g蛋白质,然后评估乳铁蛋白及其铜锌增补乳铁蛋白的免疫和抗炎活性。采用小鼠脾细胞和小鼠巨噬细胞(RAW264.7)为体外模型,评估所选样品的免疫活性;另外,以脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)为炎症模型,评估所选样品的其抗炎活性;最终,揭示铜锌增补对乳铁蛋白的免疫和抗炎活性的影响作用。通过利用CCK-8法,确定牛乳铁蛋白及铜锌增补乳铁蛋白在所选用的3个浓度下(10、20和40μg/mL)对脾细胞、ConA诱导的T淋巴细胞和LPS诱导的B淋巴细胞的增殖抑制作用大小,采用中性红法测定RAW264.7巨噬细胞吞噬作用,流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群分型(CD4~+和CD8~+)的比例,ELISA法测定细胞因子含量(干扰素-γ、白细胞介素-2和白细胞介素-4,脾细胞;肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β,巨噬细胞),最终确定铜锌增补对乳铁蛋白体外免疫活性的影响。结果表明,乳铁蛋白和铜锌增补乳铁蛋白对脾细胞、ConA诱导的T淋巴细胞和LPS诱导的B淋巴细胞均有一定的增殖抑制作用。低水平铜/锌增补(0.16mg/g蛋白质)和低剂量(10μg/mL)确实能够显著地减缓乳铁蛋白对脾细胞的抑制作用(P0.05)。与乳铁蛋白相比,低水平铜锌增补的乳铁蛋白在低剂量下对巨噬细胞的刺激作用略微增加,提高ConA刺激的脾细胞中T淋巴细胞亚群CD4~+/CD8~+比例,同时,显著地明显促进脾淋巴细胞分泌细胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)和RAW264.7巨噬细胞分泌细胞因子(IL-1β和TNF-α)(P0.05)。然而,与在低剂量下的结果相比,大多数情况下,高水平铜锌增补(0.64 mg/g蛋白质)的乳铁蛋白在高剂量下对这些细胞产生相反的作用。整体上,铜锌增补乳铁蛋白能够减缓或增加乳铁蛋白对两种免疫细胞的影响。利用CCK-8法,确定牛乳铁蛋白及铜增补乳铁蛋白在所选用的4个浓度下(10、20、40和80μg/mL)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞细胞活性的影响。测定乳酸脱氢酶(LDH)活力进行细胞毒性测定,采用Griess法测定巨噬细胞分泌的NO含量,DCFH-DA法测定RAW264.7巨噬细胞内的活性氧(ROS)水平,ELISA法测定RAW264.7巨噬细胞释放的PGE_2、TNF-α、IL-6和IL-1β含量,最终确定铜增补对乳铁蛋白抗炎活性的影响。结果表明,乳铁蛋白和铜增补乳铁蛋白对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞分泌NO、PGE_2、TNF-α、IL-6和IL-1β炎性介质和细胞中ROS水平均有一定抑制作用,表明其具有抗炎活性。与乳铁蛋白相比,低水平铜增补并在低剂量下的乳铁蛋白的抗炎效果更为明显(P0.05)。综上所述,铜锌增补能够降低或增强乳铁蛋白的免疫作用或抗炎活性,并且低水平铜锌增补、低剂量下产生更强的免疫作用和抗炎活性。所以,Cu~(2+)/Zn~(2+)含量是影响乳铁蛋白免疫作用或抗炎活性的重要因素之一。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.21
【图文】：

序列,乳铁蛋白,铁蛋白,牛乳

是生物活性。铁饱和型乳铁蛋白（即 holo-LF）对蛋白水解的抗性增加癌活性增加，抑制肿瘤细胞生长[3,82]。缺铁型乳铁蛋白（即 apo-LF）能够平促进巨噬细胞的吞噬活性[83]。除了铁，其他微量元素结合乳铁蛋白也会活性的改变。例如，增补硒能够提高乳铁蛋白的抗氧化作用[84]；而乳铁蛋脊髓灰质炎病毒 I 型感染和嗜肺军团菌的抑制作用增加[85,86]。KLFVPALLSLGALGLCLAAPRKNVRWCTISQPEWFKCRRWQWRMKKLGAVRRAFALECIRAIAEKKADAVTLDGGMVFEAGRDPYKLRPVAAEIYGTKEYYAVAVVKKGSNFQLDQLQGRKSCHTGLGRSAGWIIPMGILRPYLSWTESGAVAKFFSASCVPCIDRQAYPNLCQLCKGEGENQCACSSREPYFGYSGAFGAGDVAFVKETTVFENLPEKADRDQYELLCLNNSRAPVDAFKECHLAQVVARSVDGKEDLIWKLLSKAQEKFGKNKSRSFQLFGSPPGQRDLLFKDSALPSKVDSALYLGSRYLTTLKNLRETAEEVKARYTRVVWCAVGPEEQKKCQQQSGQNVTCATASTTDCIVLVLKGEADALNLDGGYIYTAGKCGLVPVLAENKHSSLDCVLRPTEGYLAVAVVKKANEGLTWNSLKDKKSCHTAVDRTAGWGLIVNQTGSCAFDEFFSQSCAPGADPKSRLCALCGDDQGLDKCVPNSKEKTGAFRCLAEDVGDVAFVKNDTVWENTNGESTADWAKNLNREDFRLLCL图 1-1 牛乳铁蛋白一级结构序列（NCBI, L08604）Fig.1-1 Primary structure of Bovine LF

技术路线图,有限公司,公司,美国

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T淋巴细胞亚群,脾细胞,分型,剂量

F、LF-Cu-10 和 LF-Cu-40 对 ConA 诱导的脾细胞中 T 淋巴细胞亚群分型的影CD4+; Q1：CD8+）白对照； (B)：LF（10 μg/mL）；(C)：LF-Cu-10（10 μg/mL）；(D)：LF-C；(E)：LF（40 μg/mL）；(F)：LF-Cu-10（40 μg/mL）；(G)：LF-Cu-40（40 Effects of LF, LF-Cu-10, and LF-Cu-40 on T-lymphocyte subpopulations (Q4, C in ConA-stimulated splenocytes. The cells were cultured with culture medium atreated with LF, LF-Cu-10, and LF-Cu-40 at dose level of 10 μg/mL (B D), or trethem at dose level of 40 μg/mL (E G), respectively.空白组细胞相比，LF-Zn-10 处理的细胞 CD4+比例增加（36.9-40.4%），CD 15.4%）。LF-Zn-10 在 10 μg/mL 剂量下对 CD4+呈现较强的刺激作用，而在激作用减弱。对 CD8+来说，LF-Zn-10在 10 μg/mL剂量下的作用不显著而在现出一定的抑制作用。LF-Zn-40 在 10 μg/mL 剂量下显示出刺激作用，CD.5%，但是 CD8+比例变化不显著（为 15.6%）。然而，LF-Zn-40 在 40 μg/m的抑制作用，CD4+和 CD8+比例均下降。总而言之，LF-Zn-10 和 LF-Zn-40 在能导致 CD4+比例增加，而在 40 μg/mL 剂量下导致 CD4+比例降低或增加幅是，LF-Zn-10 和 LF-Zn-40 处理后，CD4+/CD8+值分别为 2.62 2.79 和 2.210 和 LF-Zn-40 分别显示出最强和最弱的能力来提高 CD4+/CD8+比例。这些结

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