酿酒酵母来源的几丁质脱乙酰酶脱乙酰化模式研究

发布时间：2020-07-10 20:06

【摘要】：甲壳素是由β-1,4-糖苷键相连接的N-乙酰-D-氨基葡萄糖残基组成,是甲壳类动物(如虾,蟹和贝类)外骨骼的主要组成成分。甲壳素是一种可再生的原料,自然界每年生物合成的甲壳素约有1000亿吨之多约,其产量仅次于纤维素,是自然界中第二丰富的天然生物聚合物。甲壳素作为一种新型功能材料,在各个领域引起了广泛关注。但是它不溶于水和大多数有机溶剂,这种性质严重地限制了它的开发和应用。甲壳素可通过完全脱乙酰化或部分脱乙酰化并水解转化为壳寡糖(COS)。COS是一种结构多样的功能性生物聚合物家族。COS的结构可用三个来描述参数:聚合度(DP),乙酰化程度(DA)和乙酰化模式(PA)即GlcN和GlcNAc的排列顺序。虽然我们对COS分子中DP和DA的结构功能关系有了基本的了解,但对PA的影响知之甚少。由于缺乏具有特定PA的COS和合适的分析方法,COS的PA的难以通过实验解决,因此阐明壳聚糖的乙酰化模式和分子结构与功能之间的关系具有挑战性。且化学法生产的壳聚糖总显示出随机的乙酰化模式,相反,由几丁质脱乙酰酶(CDA)产生的COS可具有特定的乙酰化模式,如一些细菌CDA所示。然而,与我们对细菌CDA的了解相比,我们对真菌CDA产生具有特定乙酰化模式的COS知之甚少。本论文从CAZY数据库中调研得到来源于糖苷水解酶第四家族(Carbohydrate Esterase Family 4,CE 4)的几丁质脱乙酰酶(CDA)。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为研究对象,表征了来自酿酒酵母的几丁质脱乙酰酶(ScCDA_2)详细的脱乙酰化机制并对它的反应产物(部分乙酰化的壳寡糖)进行了分离。实验表明ScCDA_2可以产生完全确定的COS解决了化学生产的壳寡糖乙酰化模式的随机化。ScCDA_2还分别对结晶几丁质和胶体几丁质表现出约8%和20%的脱乙酰活性。此外,开发了一种通过高效液相色谱和电喷雾电离质谱(HPLC-ESI-MS)系统分离和检测部分乙酰化壳聚糖寡糖的方法,该方法快速方便,可在线监测。质谱测序显示,ScCDA_2分别产生具有DAAA,ADAA,AADA,DDAA,DADA,ADDA和DDDA的特异性乙酰化模式的COS。因此,Sc CDA_2不会使最靠近低聚物还原端的GlcNAc单元去乙酰化,ScCDA_2对几丁质寡糖具有多重攻击的催化机制。这种特定的作用模式显著地丰富了现有的几丁质脱乙酰酶脱乙酰化模式库。这些完全定义的COS可用于COS结构和功能的研究。
【学位授予单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS261.11
【图文】：

示意图,几丁质,连接方式,示意图

生物概述源及分类素、甲壳质、几丁聚糖是由 N-乙酰氨基葡萄糖（GlcN葡萄糖单元之间的键）连接的线性多糖[1]，如图 1 所壳类动物（如螃蟹，龙虾和虾）和昆虫的外骨骼的主洋生态系统中含量最丰富的多糖，其产量仅次于纤维型的结晶形式 α，β 和 γ 存在，并且他们的乙酰化程度细胞壁、虾壳，昆虫表皮以及蟹和龙虾腱和壳中。在列[4]。因此，α-几丁质在自然界中是最稳定形式的几）的甲壳素原纤维[5]。β-几丁质通常存在于鱿鱼的内骨平行取向排列，并且几丁质纤维的结晶度指数为约 70得该形式更具反应性且易溶于溶剂[2]。γ-几丁质由 α-和条平行的聚合物链与一条反平行链交替排列[6]。

示意图,酶法,壳聚糖,示意图

图 1.2：酶法壳聚糖的形成的示意图Fig1.2：Schematic diagram of the formation process of chitosan by enzymes.聚糖的脱乙酰度（％DD）可以通过 NMR 光谱测定，商业壳聚糖中的％DD 0％。平均而言，商业生产的壳聚糖的分子量为 3800 至 20,000 道尔顿。合成壳聚方法是使用过量的氢氧化钠作为试剂和水作为溶剂使壳多糖脱乙酰化[10]。尽管反进行，但遵循一级动力学;第一阶段的活化能垒在 25-120℃时估计为 48.8 kJ mol-二阶段的屏障[11]。当允许几丁质完全脱乙酰化时，该反应途径产生高达 98％的产物中的氨基具有~6.5 的 pKa 值，这导致中性溶液中的显着质子化，随着酸度的增加这使得壳聚糖具有水溶性和生物粘附性，并且易于结合带负电的表面，如粘膜。够增强极性药物在上皮表面的转运，并且是生物相容的和可生物降解的[12]。尽管尚未获得 FDA 批准用于药物输送。纯净的壳聚糖可用于生物医学应用，研究发和壳聚糖可用于制备纳米纤维[13]。

序列,多序列比对,序列,肺炎链球菌

脱乙酰酶之间进行基于结构的多序列比对。ScCDA2的序列与来自海洋节的 ArCE4A 序列，来自浅青紫链霉菌（Streptomyces lividans）的 S1CE肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的 SpPgdA 序列（PDB ID：2C色背景突出显示，催化氨基酸标记为黄色三角形。能够与 Zn2+形成配位。序列上方的符号代表二级结构，螺旋代表 α-螺旋，箭头代表 β 折叠。ture-based on sequence alignments between four CDAs. The sequence ofA sequences from a marine Arthrobacter species (PDB ID: 5LFZ), the Sllividans (PDB ID: 2CC0) and the SpPgdA sequence from Streptococcus pneunserved motifs are highlighted by a red background and the catalytic amw triangle. Amino acids capable of forming coordinate bonds with Zn2+aresymbol above the sequence represents the secondary structure, helices represents the beta fold.乙酰酶 ScCDA2基因克隆

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