糖基化蛋清蛋白的制备、性质及其在纳米颗粒中的应用

发布时间：2020-07-10 19:12

【摘要】：鸡蛋蛋清是非常重要的食品工业原料,对食品的营养、质地和风味有着重要影响,但是,相较于新鲜蛋清,经喷雾干燥的蛋清粉中蛋清蛋白(EWP)的功能性质显著下降。因此,如何利用安全的改性手段提高EWP的功能性质则显得尤为重要。本论文利用低聚糖通过干法糖基化对EWP进行结构修饰,考察糖基化对EWP结构、理化性质和功能性质的影响,从而关联结构变化与功能性质改善之间的关系,揭示糖基化改善EWP功能性质的机理。本论文为EWP糖基化改性技术提供了系统的理论指导,为开发高性能专用蛋粉和扩大EWP的工业应用提供了有用信息。具体研究结果如下:1)使用四种低聚糖:低聚果糖(FO)、低聚异麦芽糖(IMO)、抗性糊精(RMD)和麦芽糊精(MD)经干热美拉德反应(60℃、相对湿度79%)对EWP进行糖基化改性,分别考察了EWP与四种糖的接枝产物的理化性质(溶解度、接枝度、褐变程度和氨基酸组成)和功能性质(凝胶性与乳化性),结果显示,用IMO糖基化的EWP表现出更高的糖基化程度和更好的凝胶、乳化性质。并选择IMO-EWP接枝物进一步研究了糖基化对EWP结构的影响。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明糖基化增加了EWP主要蛋白分子的相对分子质量,促进了蛋白分子之间的交联,并通过糖蛋白染色证明糖链已经接枝到EWP分子上;液相色谱-质谱联用技术(GC-MS)表明糖基化过后EWP的质荷比发生了明显改变;利用傅立叶变换红外光谱(FTIR)检测到美拉德反应初级产物-席夫碱的结构特征,这些结果证实了糖基化反应的发生。此外,糖基化降低了EWP中310-螺旋结构的含量,增加了分子内和分子间氢键β-折叠。2)为了考察糖基化EWP的乳化特性,利用IMO与EWP干热美拉德反应3天制备糖基化产物IMO-EWP,并考察了IMO-EWP在温和pH(6.0-9.0)下制备的乳液的性质及理化稳定性。结果表明,糖基化提高了EWP的表面疏水性。由IMO-EWP制备的乳液粒径较EWP乳液小,而且ζ-电位与界面蛋白含量明显高于EWP乳液。相较于EWP,IMO-EWP的DPPH与ABTS自由基清除活性增强,从而提高了乳液的氧化稳定性;IMO-EWP制备的乳液,其储藏稳定性、热稳定性与盐耐受性都明显强于EWP制备的乳液。乳液的物理稳定性受pH影响较大,随着pH的增大,乳液的稳定性增强。此外,接枝物乳液的流变性质高度依赖于蛋白浓度和油含量。3)利用IMO-EWP接枝物研究了EWP经糖基化修饰后的凝胶性质及参与凝胶形成的分子间作用力的变化。流变学行为表明,随着糖基化时间的延长,储能模量G′逐渐增加,且形成热诱导IMO-EWP凝胶所需的时间更短,形成凝胶网络的二硫键减少。通过加入蛋白变性剂来考察糖基化对EWP形成凝胶的分子间作用力的影响,结果也表明,氢键和疏水相互作用显著增加,二硫键比例减少。糖基化EWP热诱导凝胶的断裂强度、结合水弛豫比和持水能力(WHC)显著增强,并且WHC和凝胶断裂强度存在正相关关系。扫描电子显微镜照片表明,接枝物的凝胶具有更细密的网络结构。说明糖基化改性导致形成凝胶分子间作用力的变化,形成了更致密的凝胶网络结构,从而提高了凝胶的断裂强度、结合水含量和持水能力。4)由于EWP的热稳定性差,因此在中性环境和高于蛋白变性温度条件下制备EWP热诱导纳米颗粒仍存在重要挑战。在本章中,考察了糖基化度EWP热聚集行为的影响,并研究了不同蛋白浓度、温度、pH、离子强度和糖基化程度(DG)对IMO-EWP热聚集行为的影响。并用IMO-EWP于90℃加热30 min制备纳米颗粒。同时,为了进一步揭示纳米颗粒的形成机理,比较了EWP和IMO-EWP接枝物之间的结构、热变性性质和表面性质的差异。结果表明,由糖基化引起的热稳定性的增强、表面净负电荷的增加以及糖链引起的空间位阻,显著抑制了EWP的热聚集,并且随着糖基化程度的增加而增强。同时,在NaCl存在下,在pH 3.0、7.0和9.0下获得纳米级颗粒(直径200 nm)。5)为了研究热诱导纳米颗粒作为水包油乳液稳定剂的潜力,在pH 6.0-9.0,利用IMO-EWP接枝物于90℃加热30 min制备纳米颗粒(HIN),并考察其制备的乳液的性质。与EWP热诱导聚集体(HEA)相比,HIN的粒径更小(100 nm),且表面疏水基团和净电荷更多。由HIN制备的乳液的粒径比EWP、IMO-EWP和HEA制备的乳液粒径更小且更均匀。与IMO-EWP和EWP相比,HIN制备的乳液在油-水界面具有最高的蛋白吸附性能力,导致其在油滴表面形成了致密的界面层。通过测量储存(1-28天),氧化(储存28天),加热(90℃加热30 min)和盐(0-150 mM NaCl)稳定性来评价乳液在pH 6.0-9.0的稳定性。结果表明,HIN稳定的乳液表现出更高的氧化稳定性,并且在pH 6.0-9.0下储存期间乳液液滴没有发生聚集,且粒径只是略微增加。此外,通过具有热稳定结构的IMO-EWP和HIN制备的乳液在pH 7.0-9.0下显示出良好的热稳定性,并且对150 mM NaCl具有高耐受性。总之,HIN稳定的乳液在改性的EWP中表现出最佳的物理化学稳定性。这些发现可能对基于EWP的乳液的制备具有重要意义。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS253.1
【图文】：

美拉德反应,多糖

图 1-2 美拉德反应的各阶段及产物特征[22]Fig. 1-2 Stages of the Maillard reaction and sub-products characteristics[22]通过美拉德反应形成的蛋白-糖接枝物作为活性成分的载体，可以充当增强食品功能特性的添加剂，包括凝胶性质、乳化剂、稳定剂、抗氧化剂和抗微生物活性，降低蛋白过敏性[18, 26, 31, 32, 34-38]。研究表明，通过美拉德反应得到的糖-蛋白接枝物能性质取决于蛋白质的构象和糖的特殊性质，如疏水性和粘度。多糖只有一个还原端的羰基作为反应基团与蛋白质的氨基结合。与蛋白质反应的多糖的数量取决于蛋的构象，并受多糖空间位阻的限制[39]。蛋白质在其自然状态下可以与一到两个多糖，而变性的蛋白质则可以与几个碳水化合物结合。例如，在酪蛋白中，四个赖氨酸在变性状态下与多糖发生反应，因为在这种情况下赖氨酸残基比蛋白在其自然状态容易发生反应。相对于单糖和二糖的高反应活性，多糖的低反应活性和空间位阻限美拉德反应的程度，减少了后续的糖基化反应，防止了过度的颜色变化和蛋白聚集功能性质还取决于糖链的长度和胺基与羰基之间的键数。2.2 美拉德反应的影响因素和方法应用于食品的接枝物必须能够增强功能性质，并且要对颜色或风味的改变尽可

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论文的主要框架

糖基化,低聚糖,颜色变化,混合物

图 2-1 低聚糖与 EWP 混合物随糖基化时间的颜色变化（糖/蛋白比例为 10%）(a) - (d)：分别为 FO-EWP、IMO-EWP、RMD-EWP 和 MD-EWP 接枝物。每张图中用不同字母代表不同样品在同一指标具有显著性差异（p < 0.05）Fig. 2-1 The color changes of sugar-EWP mixtures after glycation for different times (sugar/ protein ratio isof 10%). (a) - (d): FO-EWP, IMO-EWP, RMD-EWP and MD-EWP conjugates, respectively. Differentletters represent significant differences (p < 0.05)美拉德反应发生在蛋白质的 ε-氨基和糖类的还原端羰基之间。表 2-2 为糖基化反应后 EWP 氨基酸组成的变化。据报道，参与接枝反应的游离氨基主要来自蛋白质的赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）[18]。如表 2-2 所示，四种糖-EWP 接枝物的 Lys 含量均小于原始 EWP，并且糖基化后 IMO-EWP、MD-EWP 和 RMD-EWP 的 Arg 含量也降低。赖氨酸和精氨酸含量的降低进一步证实了 EWP 和四种糖之间发生了糖基化反应。此外，IMO-EWP 和 MD-EWP 中赖氨酸和精氨酸含量的减少高于 RMD-EWP 和 FO-EWP，这与 DG 的结果一致（表 2-1）。

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