枯草芽孢杆菌芽孢表面展示黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶的研究

发布时间：2020-07-14 00:21

【摘要】：农药与人们的生活息息相关。为保证农作物的产量,人们在田地中大量施放农药,造成土壤中农药累积,可能会威胁环境和食品安全。有机磷类农药是使用量最多的农药之一,会造成慢性中毒(如神经系统失调、脏器毒性、癌症、出生缺陷、生殖毒性等)。在2010年至2018年之间,已经发生多起因误食有机磷农药残留超标的蔬菜引发的食物中毒事件。国家标准规定的气相色谱检测方法需要昂贵仪器,不适用于日常快速现场检测。机磷农药可特异性地不可逆抑制动物神经系统中乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性,酶抑制法是根据AChE活性受到抑制程度来测定有机磷农药残留量的方法。具有检测快速、设备和试剂简单、成本低等特点,适合水果蔬菜有机磷农药残留量的检测。目前,AChE主要从昆虫或动物血液中提取,产量低、成本高、酶活性不稳定,严重阻碍了AChE在农药残留检测中的应用。本论文获得黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶(DmAChE)。将其基因连接到pHT43质粒中并实现大肠杆菌内复制扩增并提取,再将提取的质粒转入到枯草芽孢杆菌WB800N中获得重组菌株pHT43-ache-WB800N,经IPTG诱导表达DmAChE,并通过western blot检测成功表达DmAChE。酶学性质研究表明,DmAChE酶活力为53U/mg,Km值为0.058mmol/L;最适酶反应温度为30℃,最适pH值为7。在上述工作基础上,我们以芽孢表面展示技术实现了DmAChE的固定化,提高了该酶的环境耐受性。将黑腹果蝇的乙酰胆碱酯酶基因与六种芽孢衣壳蛋白(CotB、CotC、CotG、CotX、CotY、CotZ)共同连接到pHT43载体上,将其转化入枯草芽孢杆菌WB800N中并实现孢子化,通过观察不同孢子表面免疫荧光差异,确定最佳的锚定蛋白为CotG。酶学性质研究表明,其酶活性为0.7U/mg,然后检测了G-AChE在20-70℃温度下及pH=4.0-9.0的条件下的相对酶活性,发现其在70℃条件下仍能保存60%以上的相对酶活性,且对酸碱的耐受性也大大增加,在pH为4的条件下,相对酶活性依然能够达到60%以上,远高于DmAChE温度耐受性和酸碱耐受性。综上所述,枯草杆菌芽孢表面展示系统作为一种新型的抗逆性酶固定化技术,可以很好地解决目前酶抑制法检测有机磷农药时AChE酶活性不稳定的问题,希望通过后续研究可以研制出能够稳定检测有机磷农药的快速检测商品。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS255.7
【图文】：

留量检测方法测方法主要包括色谱法、酶抑制法、毛细管电泳测定各种果蔬中有机磷农药残留的方法是气、气相色谱-质谱联用法（GB 23200.97-2016 -2002 等）。气质联用法存在着分析周期长、分析过程繁琐日常生活中，缺陷十分明显。快速检测法分法具有检测快速、设备和试剂简单、成本低等留毒性的检测，受到基层疾病预防控制机构的过程中容易受到反应环境、温度等因素的影响约了速测卡法测量的可靠性。能够获得一种泛的温度适应性和环境适应性的乙酰胆碱酯活中的有机磷农药检测起到重要作用。

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本文编号：2754191