副溶血性弧菌生物被膜结构特性的初步研究

发布时间：2020-09-01 17:34

　　副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是水产品中普遍存在的致病菌,在食品加工设施及水产品表面容易形成生物被膜(Biofilm,BF),生物被膜是细菌分泌多糖、蛋白质、核酸、脂质和eDNA,统称胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances,EPS),包裹在其中的微生物群落,EPS是维持BF结构稳定性的重要基础,BF结构是引起抗生素耐药性以及消毒剂抗性增强的重要原因。本文首先建立了结构分析方法,并对食品与临床分离的副溶血性弧菌BF结构作了普查研究,进一步了解副溶血性弧菌的BF结构差异性,本文主要是以副溶血性弧菌S36(VPS-36)为研究对象,探究了VPS-36 BF生长过程中结构和化学物质的相关性,结果显示eDNA与VPS-36 BF结构相关性最大,然后进一步探究了eDNA在VPS-36 BF结构稳定性中的作用。本文各章节研究内容及对应的结果如下:1.结构分析方法的建立及副溶血性弧菌生物被膜结构的普查副溶血性弧菌是水产品中常见的食源性致病菌,生物被膜的形成对副溶血性弧菌的环境生存和传播至关重要。目前对不同来源的副溶血性弧菌生物被膜的比较基于结晶紫测定,不能比较结构性的差异性。本文使用高吞吐量共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)成像方法结合结构分析软件ISA-2,建立了一种结构分析方法,分析22株食品与22株临床来源菌株形成的BF结构参数(生物体积,平均厚度,粗糙系数)的差异性,结果显示临床菌株BF的变异系数比环境菌株BF的变异系数小,且同时携带tdh和trh两种毒力因子的菌株BF变异性最小。凝聚层次聚类分析(AHC)结果显示副溶血性弧菌BF可以分为致密且表面光滑(39%),斑驳且表面粗糙(27%),疏松且表面坑洼(34%),临床菌株形成易形成致密且表面光滑和斑驳且表面粗糙的生物被膜,而环境菌株易形成斑驳且表面粗糙和疏松且表面坑洼的生物被膜。该研究提供了对副溶血性弧菌生物被膜结构的深入理解。2.副溶血性弧菌生物被膜发育过程中结构和化学物质之间的相关性BF的复杂三维结构由EPS支撑,并且EPS和生物被膜结构发展中的化学变化的相关性分析提供控制BF的策略。使用共聚焦激光扫描显微镜和拉曼光谱(Raman spectroscopy,RS)研究副溶血性弧菌VPS36生物被膜的生长。通过CLSM表征生物被膜的结构参数(生物体积,平均厚度和区域孔率),结果表明VPS-36 BF在孵育48 h后形成致密的3D结构。RS结果显示EPS中的碳水化合物和核酸含量协同变化。Pearson分析显示EPS中化学成分的强度与生物体积和平均厚度呈正相关,与区域孔率呈负相关。碳水化合物的强度与平均厚度显著性相关(p-value0.01),核酸的拉曼强度与区域孔率显著性相关(p-value0.01)。3.eDNA在副溶血性弧菌生物被膜结构稳定性中作用的研究eDNA作为支架提供EPS的结构完整性,随后决定BF的三维结构,BF结构的稳定性是引起食品加工表面难以清除的重要原因。本研究评估了eDNA在VPS-36 BF结构稳定性中的作用,利用DNase I酶靶向处理,AEW非靶向处理BF的eDNA。使用CLSM观察副溶血性弧菌BF的三维活/死细胞成像,相对于对照组,结果显示DNase I酶处理的BF活细胞含量减少(p=0.012),死细胞含量增多(p=0.017),而AEW处理的BF活细胞含量减少(p=0.011),死细胞含量没有显著性差异(p=0.980),我们猜测AEW处理之后导致BF结构的崩解,活细胞和死细胞均从被膜结构中逃逸。透射电镜(TEM)观察DNase I酶和AEW对BF结构有破坏作用,eDNA定量结果显示存在显著性差异(p=0.002,p=0.001)。RT-QPCR结果显示DNase I酶和AEW对副溶血性弧菌BF形成的群体感应基因aphA,毒力表达基因opaR以及荚膜多糖cpsA,cpsQ,cpsR基因均有显著性破坏作用(p0.01)。因此,AEW是一种有效的,环保,安全和廉价的消毒杀菌剂,可以通过破坏eDNA从而消除BF。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS254.1
【部分图文】：

生物被膜

图 1-1 生物被膜形成过程[7]。Figure 1-1 Biofilm formation process[7].3 影响生物被膜形成的因素在 BF 形成过程中，底物和细胞表面的性质，周围环境因素和细菌遗传调控在可逆或不可逆附着中起重要作用[6]。3.1 载体材料的物理性质食品加工业中表面的物理特性对于 BF 形成非常重要，因为它们影响细菌初始附着。一般载体材料的表面张力、粗糙度以及疏水性会对细菌粘附和 BF 的形成造成一定的影响[11]。相对于疏水性材料表面（PPR、PPC、玻璃），细菌更倾向与粘附在亲水表面（不锈钢）。PPR、PPC、玻璃和不锈钢等是食品加工设备常用的接触材料，李燕杰等人[12]研究了这几种常见食品加工材料对单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)BF 形成的影响，结果表明四种材料表面均可以形成稳定的 BF，材料粗糙度对形成 BF 有显著影响，且粗糙度越大，越易形成 BF。抑制

技术路线图

副溶血性弧菌,结构参数,生物被膜,生物体

Table 2-3. Coefficient variation of biofilms formed by 44 Vibrio parahaemolyticus strains.Biofilm Parameters BV(×105μm3)AT(μm)BRClinical strains 13.39±4.81 12.05±4.03 0.64±0.24CV 36.46% 33.41% 36.69%Environmental strains 13.44±6.00 11.67±4.83 0.71±0.30CV 44.65% 41.35% 42.92%tdh+/trh+13.63±4.34 11.58±3.78 0.70±0.25CV 31.86% 32.65% 35.27%tdh+/trh-12.44±5.07 4.95±1.08 1.07±0.05CV 40.77% 33.98% 35.56%tdh-/trh+15.72±5.94 5.72±0.78 1.05±0.05CV 37.79% 40.92% 51.27%tdh-/trh-12.66±5.40 5.01±1.08 1.04±0.04CV 42.63% 39.03% 40.26%

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