盐渍海带中嗜盐古菌多样性及其胞外蛋白酶研究
发布时间：2021-03-18 19:28
嗜盐古菌是古菌域中一类喜好高盐的微生物,广泛分布于各种高盐环境中。嗜盐古菌所分泌蛋白酶因其耐盐碱、耐高温和耐有机溶剂等性质,具有优良的应用潜力和重要研究价值。盐渍海带作为一种高盐市售食品,其中含有丰富多样的嗜盐古菌和高产胞外蛋白酶菌株资源。本文针对产自4个不同沿海地区的盐渍海带,从高通量测序、嗜盐古菌分离、产胞外蛋白酶菌株筛选、多相分类学鉴定、基因组测序、疑似蛋白酶基因功能验证与蛋白酶的异源表达和纯化、酶学性质表征等方面开展研究,聚焦盐渍海带中嗜盐古菌的多样性、产胞外蛋白酶新种的特性与分类学地位、嗜盐蛋白酶酶学性质以及嗜盐蛋白酶C端延伸区（C-terminal extension,CTE）结构域功能,以期为产嗜盐蛋白酶菌株与嗜盐蛋白酶的开发利用提供科学依据。首先,以辽宁大连（DLLS）、山东荣成（RC）、江苏连云港（LYG）、福建霞浦（XP）生产盐渍海带为研究对象,通过高通量测序分别获得154、152、139和61个OTU。从DLLS样品分离获得85株嗜盐古菌分属于15个属的25个种,从RC样品分离获得87株嗜盐古菌分属于14个属的29个种,从LYG样品分离获得83株嗜盐古菌分属于13...
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：177 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
嗜盐古菌从门水平到属水平的分类Figure1.1ClassificationofHaloarchaeafromphylumtogenus[56]
盐渍海带中嗜盐古菌多样性及其胞外蛋白酶研究41.1.5嗜盐古菌蛋白的耐盐机制特定蛋白质的最终结构和功能取决于蛋白质的核心和表面残基与溶解蛋白质的溶剂之间的相互作用[57]。高盐条件下疏水相互作用通常引起蛋白质的溶解度、结合能力、稳定性、结晶性、蛋白质聚集和沉淀等性质发生变化[58,59]，使蛋白质结构在高盐浓度下不稳定。但是盐的存在对于维持嗜盐蛋白质/酶的活性构象至关重要[60]。一些研究发现，在低浓度的盐或无盐时嗜盐蛋白的结构稳定性和酶活性丧失[60,61]。嗜盐蛋白具体耐盐机制有三类：（1）嗜盐蛋白特殊的氨基酸组成嗜盐蛋白的特殊氨基酸组成是其在高浓度盐溶液中具有高溶解性和对有机溶剂的抗性的关键原因[62]。由于酸性氨基酸的水合羧基，使嗜盐蛋白表面带有负电荷。表面的负电荷被大量的阳离子屏蔽，这可防止蛋白展开并保持其溶解度[58,60,63,64]（图1.2）。嗜盐微生物的蛋白质的酸性氨基酸比例相对较高，如丝氨酸、苏氨酸[65]、天冬氨酸、谷氨酸[66]、丙氨酸、缬氨酸[61,67]。此外，嗜盐蛋白还包含少量的非极性氨基酸，如半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸残基[61,66,67]。此特征还与嗜盐蛋白的低pI值（4.2至6.8）有关[68-70]。图1.2嗜盐蛋白的盐稳定性Figure1.2Saltstabilityofhalophilicproteins[71]注：（A）酸性氨基酸赋予蛋白质表面带负电荷的酶/蛋白质（变性构象）；（B）蛋白质表面的负电荷被阳离子中和，例如Na+（活性构象）。
盐渍海带中嗜盐古菌多样性及其胞外蛋白酶研究10C450_13147[121]。部分嗜盐古菌却不能产胞外蛋白酶，从Haloarculamarismortui的完整基因组序列并没有预测出halolysin基因[122]。已发现的嗜盐古菌胞外蛋白酶都可被丝氨酸蛋白酶抑制剂（如苯基甲基磺酰氟PMSF，氟磷酸二异丙酯DFP）和枯草杆菌蛋白酶特异性抑制剂（如链霉菌的枯草杆菌蛋白酶抑制剂，ovomucoid卵类粘液）抑制而失活（表1.1）。结合对已有基因序列的嗜盐古菌胞外蛋白酶分析，嗜盐古菌胞外蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，并且均为枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶（subtilase），丝氨酸蛋白酶亚家族S8A成员（COG1404），被称为halolysin。目前已知蛋白序列的嗜盐古菌蛋白酶都是由4部分结构域组成，分别为信号肽、N端前肽、丝氨酸蛋白酶家族催化结构域和C端延伸区结构域（CTE）。1.3.2Halolysin自催化成熟机制图1.3halolysin的自催化成熟机制Figure1.3Autocatalyticmaturationmechanismofhalolysin[123,124]注：（a）图为Nep自催化成熟示意图；（b）图为SptA自催化成熟示意图。Halolysin自催化成熟机制在SptA和Nep中有过详细报道，与大多数subtilase一样，都是由蛋白酶前体自催化逐步切割成熟[123,124]（图1.3），不同的是最后的成熟酶包含催化结构域和CTE结构域。halolysin的信号肽含有双精氨酸基序（RR）为Tat信号肽，Tat途径能够转运完全折叠的蛋白质[125]。halolysin前体在胞内部分折叠或完全折叠，经Tat途径分泌到胞外，该过程中信号肽被切除，形成蛋白酶酶原。去除信号肽对于Nep的自催化成熟可能是必要的[124]，但对于SptA激活不是必需的[123]。N端前肽在蛋白酶中作为分子伴侣帮助酶原正确折叠，同时
【参考文献】：
期刊论文
[1]我国鲜海带加工的综合利用[J]. 李晓川. 中国水产. 2012(10)
博士论文
[1]嗜盐蛋白酶SptC的成熟机制及其几丁质结合结构域功能的研究[D]. 张瑶心.武汉大学 2014
[2]极端嗜盐古菌Tat途径底物SptA的成熟与分泌机制研究[D]. 杜欣.武汉大学 2014
硕士论文
[1]大连盐场与茶卡盐湖嗜盐古菌多样性及胞外蛋白酶研究[D]. 李杨.江苏大学 2018
[2]新疆地区盐碱环境嗜盐古菌多样性与产胞外蛋白酶研究[D]. 周瑶.江苏大学 2018
[3]风味蛋白酶酶解海带制备海鲜调味料的研究[D]. 张晓羽.大连工业大学 2018
本文编号：3088810
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：177 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
嗜盐古菌从门水平到属水平的分类Figure1.1ClassificationofHaloarchaeafromphylumtogenus[56]
盐渍海带中嗜盐古菌多样性及其胞外蛋白酶研究41.1.5嗜盐古菌蛋白的耐盐机制特定蛋白质的最终结构和功能取决于蛋白质的核心和表面残基与溶解蛋白质的溶剂之间的相互作用[57]。高盐条件下疏水相互作用通常引起蛋白质的溶解度、结合能力、稳定性、结晶性、蛋白质聚集和沉淀等性质发生变化[58,59]，使蛋白质结构在高盐浓度下不稳定。但是盐的存在对于维持嗜盐蛋白质/酶的活性构象至关重要[60]。一些研究发现，在低浓度的盐或无盐时嗜盐蛋白的结构稳定性和酶活性丧失[60,61]。嗜盐蛋白具体耐盐机制有三类：（1）嗜盐蛋白特殊的氨基酸组成嗜盐蛋白的特殊氨基酸组成是其在高浓度盐溶液中具有高溶解性和对有机溶剂的抗性的关键原因[62]。由于酸性氨基酸的水合羧基，使嗜盐蛋白表面带有负电荷。表面的负电荷被大量的阳离子屏蔽，这可防止蛋白展开并保持其溶解度[58,60,63,64]（图1.2）。嗜盐微生物的蛋白质的酸性氨基酸比例相对较高，如丝氨酸、苏氨酸[65]、天冬氨酸、谷氨酸[66]、丙氨酸、缬氨酸[61,67]。此外，嗜盐蛋白还包含少量的非极性氨基酸，如半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸残基[61,66,67]。此特征还与嗜盐蛋白的低pI值（4.2至6.8）有关[68-70]。图1.2嗜盐蛋白的盐稳定性Figure1.2Saltstabilityofhalophilicproteins[71]注：（A）酸性氨基酸赋予蛋白质表面带负电荷的酶/蛋白质（变性构象）；（B）蛋白质表面的负电荷被阳离子中和，例如Na+（活性构象）。
盐渍海带中嗜盐古菌多样性及其胞外蛋白酶研究10C450_13147[121]。部分嗜盐古菌却不能产胞外蛋白酶，从Haloarculamarismortui的完整基因组序列并没有预测出halolysin基因[122]。已发现的嗜盐古菌胞外蛋白酶都可被丝氨酸蛋白酶抑制剂（如苯基甲基磺酰氟PMSF，氟磷酸二异丙酯DFP）和枯草杆菌蛋白酶特异性抑制剂（如链霉菌的枯草杆菌蛋白酶抑制剂，ovomucoid卵类粘液）抑制而失活（表1.1）。结合对已有基因序列的嗜盐古菌胞外蛋白酶分析，嗜盐古菌胞外蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，并且均为枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶（subtilase），丝氨酸蛋白酶亚家族S8A成员（COG1404），被称为halolysin。目前已知蛋白序列的嗜盐古菌蛋白酶都是由4部分结构域组成，分别为信号肽、N端前肽、丝氨酸蛋白酶家族催化结构域和C端延伸区结构域（CTE）。1.3.2Halolysin自催化成熟机制图1.3halolysin的自催化成熟机制Figure1.3Autocatalyticmaturationmechanismofhalolysin[123,124]注：（a）图为Nep自催化成熟示意图；（b）图为SptA自催化成熟示意图。Halolysin自催化成熟机制在SptA和Nep中有过详细报道，与大多数subtilase一样，都是由蛋白酶前体自催化逐步切割成熟[123,124]（图1.3），不同的是最后的成熟酶包含催化结构域和CTE结构域。halolysin的信号肽含有双精氨酸基序（RR）为Tat信号肽，Tat途径能够转运完全折叠的蛋白质[125]。halolysin前体在胞内部分折叠或完全折叠，经Tat途径分泌到胞外，该过程中信号肽被切除，形成蛋白酶酶原。去除信号肽对于Nep的自催化成熟可能是必要的[124]，但对于SptA激活不是必需的[123]。N端前肽在蛋白酶中作为分子伴侣帮助酶原正确折叠，同时
【参考文献】：
期刊论文
[1]我国鲜海带加工的综合利用[J]. 李晓川. 中国水产. 2012(10)
博士论文
[1]嗜盐蛋白酶SptC的成熟机制及其几丁质结合结构域功能的研究[D]. 张瑶心.武汉大学 2014
[2]极端嗜盐古菌Tat途径底物SptA的成熟与分泌机制研究[D]. 杜欣.武汉大学 2014
硕士论文
[1]大连盐场与茶卡盐湖嗜盐古菌多样性及胞外蛋白酶研究[D]. 李杨.江苏大学 2018
[2]新疆地区盐碱环境嗜盐古菌多样性与产胞外蛋白酶研究[D]. 周瑶.江苏大学 2018
[3]风味蛋白酶酶解海带制备海鲜调味料的研究[D]. 张晓羽.大连工业大学 2018
本文编号：3088810
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